וקטור מבוסס DNA התערבות RNA ללמוד לתפקד גנים סרטן
Summary
התערבות RNA (RNAi) הוא בעל יתרונות רבים על פני בנוקאאוט הגן נעשה שימוש נרחב ככלי במחקרים גנים תפקודיים. המצאת ה-DNA וקטור מבוססי RNAi הטכנולוגיה הפכה לטווח ארוך הגן מושרה מציאה אפשרי, גם הגדילה את הכדאיות של השתקת הגן<em> In vivo</em>.
Abstract
התערבות RNA (RNAi) מעכב ביטוי גנים על ידי mRNAs יעד משפילים במיוחד. מאז גילויו של פעמיים תקועים התערבות RNA קטן (siRNA) בגן ההשתקה 1, RNAi הפך לכלי רב עוצמה המחקר במחקרים תפקוד הגן. לעומת מחיקה גנטית, RNAi בתיווך להשתקת גנים בעל יתרונות רבים, כגון הקלות שבה היא מתבצעת והתאמתו שורות תאים ביותר. מחקרים רבים הדגימו את היישומים של טכנולוגיית RNAi בחקר הסרטן. בפרט, פיתוח טכנולוגיית ה-DNA וקטור מבוסס לייצר סיכת ראש RNA קטן (shRNA) מונע על ידי U6 או האמרגן H1 הפכה לטווח ארוך הגן מושרה להשתיק 2,3 אפשרי. השימוש בו בשילוב עם וקטורים ויראליים מהונדסים גנטית, כמו lentivirus, מקלה על יעילות גבוהה של משלוח shRNA ו / או אינטגרציה לתוך הדנ"א הגנומי לביטוי shRNA יציב.
אנו מתארים detaileהליך D באמצעות וקטור מבוססי טכנולוגיית ה-DNA RNAi לקבוע תפקוד הגן, כולל בנייה של וקטורים lentiviral המבטאים shRNA, ייצור lentivirus וזיהום התא, ומחקרים תפקודית באמצעות מודל xenograft העכבר.
אסטרטגיות שונות דווחו ביצירת מבנים shRNA. פרוטוקול המתואר כאן העסקת הגברה PCR ו קשירת 3-שבר יכול לשמש ישירות וביעילות ליצור shRNA המכילים מבנים lentiviral מבלי לעזוב כל הצמוד נוקלאוטיד נוסף ברצף shRNA קידוד. מאז shRNA ביטוי קלטות שנוצרו על ידי אסטרטגיה זו ניתן לגזור על ידי אנזימי הגבלה, הם יכולים להעביר בקלות וקטורים אחרים עם סמנים ניאון או אנטיביוטיקה שונים. ריאגנטים transfection המסחריים יכולים לשמש בייצור lentivirus. עם זאת, בדו"ח זה, אנו מספקים שיטה כלכלית באמצעות סידן זרחתי משקעים כי ניתן להשיג על יעילות transfection של 90%293T תאים. לעומת מכוננת וקטורים shRNA הביטוי, מערכת shRNA מושרה מתאים במיוחד כדי לדפוק את הגן חיוני התפשטות תאים. אנחנו מדגימים להשתקת גנים של ין יאנג 1 (YY1), oncogene פוטנציאל בסרטן השד 4,5, על ידי ט במערכת מושרה shRNA והשפעתו על היווצרות הגידול. מחקר באמצעות lentivirus מחייב סקירה ואישור פרוטוקול בטיחות ביולוגית על ידי ועדת בטיחות ביולוגית של המוסד של החוקר. מחקרים באמצעות מודלים של בעלי חיים מחייבת בדיקה ואישור של פרוטוקול בעלי חיים על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש (ACUC) במוסד של החוקר.
Protocol
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה להפיל הגן באמצעות shRNA ולדמיין ההשפעה הביולוגית שלה באמצעות הדמיה bioluminescent גידול תאים סרטניים in vivo. אתר היעד של shRNA לא יכילו כל אחד משלושת אתרי הגבלה (BamHI, HindIII ו EcoRI) משמש עבור subcloning. בתרחיש נדיר כאשר כל אחד מהאתרים הללו קיים, אנזים הגבלה נוספת שנ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי מחקר המלומדת (116403-RSG-09-082-01-MgO) של האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן וקופות המיפוי של אוניברסיטת Wake Forest למדעי הבריאות ל GS. DBS נתמך על ידי NCI אימון מענק 5T32CA079448.
Materials
In addition to common laboratory equipment used for RNA and protein analyses and cell culture, the following materials and reagents are required for this protocol.
| Name of the reagent |
| Biosafety Cabinet suitable for Biosafety Level 2 containment |
| PCR thermocycler |
| Ultracentrifuge |
| Anesthesia-induction chamber with isoflurane scavengers |
| Digital Vernier caliper |
| IVIS imaging system |
| Highly competent DH5a E. coli |
| EcoRI, BamHI, & HindIII restriction enzymes |
| T4 DNA Ligase |
| Third generation lentivirus packaging plasmids VSV-G, pRSV-Rev and pMDLg/pRRE |
Materials List
References
- Elbashir, S. M. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Sui, G. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553 (2002).
- Zhang, Q., Stovall, D. B., Inoue, K., Sui, G. The oncogenic role of Yin Yang 1. Crit. Rev. Oncog. 16, 163-197 (2011).
- Wan, M. Yin Yang 1 plays an essential role in breast cancer and negatively regulates p27. Am. J. Pathol. , (2012).
- Sui, G., Shi, Y. Gene silencing by a DNA vector-based RNAi technology. Methods in Molecular Biology. 309, 205-218 (2005).
- Trower, M. K. A rapid PCR-based colony screening protocol for cloned inserts. Methods Mol. Biol. 58, 329-333 (1996).
- Lizee, G. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
- Zhang, B. The significance of controlled conditions in lentiviral vector titration and in the use of multiplicity of infection (MOI) for predicting gene transfer events. Genet Vaccines Ther. 2, 6 (2004).
- Geran, R. I., Greenberg, N. H., MacDonald, M. M., Schumacher, A. M., Abbott, B. J. Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems. Cancer Chemother. Rep. 3, 1-103 (1972).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96, 23-28 (1990).
- Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors. Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).
- Rubinson, D. A. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nat Genet. 33, 401-406 (2003).
- Sui, G. Yin Yang 1 is a negative regulator of p53. Cell. 117, 859-872 (2004).
