DNA Vector baseado em RNA de interferência para estudar a função Gênica em Câncer
Summary
RNA de interferência (RNAi) possui muitas vantagens sobre knockout do gene e tem sido amplamente utilizada como uma ferramenta em estudos de genes funcionais. A invenção da tecnologia de RNAi DNA vector baseado fez a longo prazo e knockdown induzível gene possível, e também aumentou a viabilidade de silenciamento do gene<em> In vivo</em>.
Abstract
RNA de interferência (RNAi) inibe a expressão de genes por mRNAs alvo especificamente degradantes. Desde a descoberta da dupla hélice pequeno RNA de interferência (siRNA) no gene silenciamento 1, RNAi se tornou uma poderosa ferramenta de pesquisa em estudos da função gênica. Comparado com deleção genética, RNAi mediada silenciamento do gene possui muitas vantagens, tais como a facilidade com que é realizado e à sua adequação para a maioria das linhas celulares. Vários estudos têm demonstrado as aplicações da tecnologia de RNAi na pesquisa do câncer. Em particular, o desenvolvimento da tecnologia de ADN recombinante baseado em vectores para produzir pequena hairpin RNA (shRNA) dirigido pelo promotor de U6 ou H1 fez a longo prazo e gene induzível silenciamento 2,3 possível. A sua utilização em combinação com geneticamente modificadas vectores virais, tais como lentivírus, facilita altas eficiências de shRNA entrega e / ou a integração no DNA genómico de expressão shRNA estável.
Nós descrevemos um pormenorizada sobred procedimento usando o DNA vector baseado em tecnologia de RNAi para determinar a função do gene, incluindo a construção de vectores que expressam lentivirais shRNA, a produção de lentivírus e infecção de células, e estudos funcionais usando um modelo de xenoenxerto de rato.
Várias estratégias têm sido relatados na geração de construções de Lentivirus. O protocolo descrito aqui empregando amplificação por PCR e uma ligação de 3-fragmento pode ser usado para gerar directamente e eficientemente shRNA contendo construções de lentivirais sem deixar qualquer adjacente adicional de nucleótidos, a uma sequência de codificação shRNA. Uma vez que os cassetes de expressão shRNA criados por esta estratégia pode ser cortado por enzimas de restrição, eles podem ser facilmente transferido para outros vetores com diferentes marcadores fluorescentes ou antibiótico. Reagentes de transfecção mais comerciais podem ser utilizados na produção de lentivírus. No entanto, neste relatório, nós fornecemos um método econômico utilizando precipitação de fosfato de cálcio que pode atingir mais eficiência de transfecção de 90% emAs células 293T. Comparado com vectores de expressão constitutiva de Lentivirus, um sistema de shRNA indutível é particularmente adequado para derrubando um gene essencial para a proliferação celular. Nós demonstramos o silenciamento do gene de Yin Yang 1 (YY1), um oncogene potencial no câncer de mama 4,5, por um Tet-On sistema induzível shRNA e seus efeitos sobre a formação de tumores. A pesquisa com lentivírus requer revisão e aprovação de um protocolo de biossegurança pelo Comitê de Biossegurança da instituição de um investigador. Pesquisas usando modelos animais requer revisão e aprovação de um protocolo animal pelo Animal Care e do Comitê de Uso (ACUC) de instituição de um investigador.
Protocol
Discussion
Este protocolo descreve um método para derrubar um gene usando shRNA e visualizar o seu efeito biológico utilizando imagiologia bioluminescente de crescimento de células tumorais in vivo. O local de destino de um shRNA não deve conter qualquer um dos três locais de restrição (BamHI, HindIII e EcoRI) utilizado para subclonagem. Num cenário raro quando qualquer destes sítios está presente, uma enzima de restrição adicional pode ser utilizada para a substituir na geração do construto.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado em parte pelas Bolsas de Investigação Scholar (116403-RSG-09-082-01-MGO) da American Cancer Society e fundos intramurais de Wake Forest University Health Sciences para GS. DBS foi apoiado pelo NCI treinamento concessão 5T32CA079448.
Materials
In addition to common laboratory equipment used for RNA and protein analyses and cell culture, the following materials and reagents are required for this protocol.
| Name of the reagent |
| Biosafety Cabinet suitable for Biosafety Level 2 containment |
| PCR thermocycler |
| Ultracentrifuge |
| Anesthesia-induction chamber with isoflurane scavengers |
| Digital Vernier caliper |
| IVIS imaging system |
| Highly competent DH5a E. coli |
| EcoRI, BamHI, & HindIII restriction enzymes |
| T4 DNA Ligase |
| Third generation lentivirus packaging plasmids VSV-G, pRSV-Rev and pMDLg/pRRE |
Materials List
References
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