DNA-vektor-baserad RNA-interferens för att studera genfunktion i Cancer
Summary
RNA-interferens (RNAi) har många fördelar jämfört med gen knockout och har i stort sett användas som ett verktyg i gen funktionella studier. Uppfinningen av DNA-vektor-baserad RNAi teknik har gjort långsiktiga och inducerbara gen knockdown möjligt och ökade också möjligheterna att geners uttryck<em> In vivo</em>.
Abstract
RNA-interferens (RNAi) hämmar genuttryck genom att specifikt nedbrytande mål mRNA. Sedan upptäckten av dubbelsträngat liten störning RNA (siRNA) i geners uttryck 1 har RNAi blivit ett kraftfullt forskningsverktyg i studier genfunktion. Jämfört med gen, har RNAi-medierad geners uttryck många fördelar, såsom den lätthet med vilken den genomförs och dess lämplighet för de flesta cellinjer. Flera studier har visat på tillämpningar av RNAi-teknik inom cancerforskningen. Framför allt har utvecklingen av DNA-vektor-baserad teknik för att producera små hårnål RNA (shRNA) drivs av U6 eller H1 promotor göras lång sikt och inducerbara gen tysta möjligt 2,3. Dess användning i kombination med genetiskt manipulerade virala vektorer, såsom lentivirus, underlättar höga effektiviteter av shRNA leverans och / eller integration i genomiskt DNA för stabil uttryckning shRNA.
Vi beskriver ett detailed procedur med hjälp av DNA-vektor-baserad RNAi teknik för att bestämma genfunktion, inklusive konstruktion av lentivirala vektorer som uttrycker shRNA, lentivirus produktion och cell infektion och funktionella studier med en modell musen xenotransplantat.
Olika strategier har rapporterats att generera shRNA konstruktioner. Det protokoll som beskrivits här använda PCR-amplifiering och en 3-fragmentet ligering kan användas för att direkt och effektivt generera shRNA-innehållande lentivirala konstruktionerna utan att lämna någon extra nukleotiden intill en shRNA kodande sekvensen. Eftersom shRNA-expressionskassetter som skapas av denna strategi kan skäras ut genom restriktionsenzymer, kan de lätt flyttas till andra vektorer med olika fluorescerande eller antibiotikum markörer. De flesta kommersiella transfektionsreagenser kan användas i lentivirus produktion. Men i denna rapport ger vi en ekonomisk metod för att använda kalciumfosfatutfällning som kan nå över 90% transfektion effektivitet i293T-celler. Jämfört med konstitutiva shRNA expressionsvektorer, är en inducerbar shRNA systemet speciellt lämpligt att taga isär en gen nödvändig för cellproliferation. Vi visar genen tysta Yin Yang 1 (YY1), en potentiell onkogen i bröstcancer 4,5, med en Tet-On inducerbara shRNA systemet och dess effekter på tumörbildning. Forskning med lentivirus kräver granskning och godkännande av ett protokoll om biosäkerhet från biosäkerhet kommittén en forskares institution. Forskning med djurmodeller kräver granskning och godkännande av ett djur protokoll från Animal Care and Use Committee (ACUC) av en forskares institution.
Protocol
Discussion
Detta protokoll beskriver en metod för att slå ner en gen med användning av shRNA och visualisera dess biologiska effekt med användning av bioluminescerande avbildning av tumörcelltillväxt in vivo. Målstället av en shRNA inte bör innehålla någon av de tre restriktionsställen (BamHI, Hindlll och EcoRI) användes för subkloning. I en sällsynt scenario när någon av dessa ställen är närvarande, kan en ytterligare restriktionsenzym användas för att ersätta den i generering av konstruktionen. </…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av forskningsbidrag Scholar (116.403-RSG-09-082-01-MgO) från American Cancer Society och intramural fonder för Wake Forest University Health Sciences till GS. DBS stöddes av NCI utbildningsbidrag 5T32CA079448.
Materials
In addition to common laboratory equipment used for RNA and protein analyses and cell culture, the following materials and reagents are required for this protocol.
| Name of the reagent |
| Biosafety Cabinet suitable for Biosafety Level 2 containment |
| PCR thermocycler |
| Ultracentrifuge |
| Anesthesia-induction chamber with isoflurane scavengers |
| Digital Vernier caliper |
| IVIS imaging system |
| Highly competent DH5a E. coli |
| EcoRI, BamHI, & HindIII restriction enzymes |
| T4 DNA Ligase |
| Third generation lentivirus packaging plasmids VSV-G, pRSV-Rev and pMDLg/pRRE |
Materials List
References
- Elbashir, S. M. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Sui, G. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553 (2002).
- Zhang, Q., Stovall, D. B., Inoue, K., Sui, G. The oncogenic role of Yin Yang 1. Crit. Rev. Oncog. 16, 163-197 (2011).
- Wan, M. Yin Yang 1 plays an essential role in breast cancer and negatively regulates p27. Am. J. Pathol. , (2012).
- Sui, G., Shi, Y. Gene silencing by a DNA vector-based RNAi technology. Methods in Molecular Biology. 309, 205-218 (2005).
- Trower, M. K. A rapid PCR-based colony screening protocol for cloned inserts. Methods Mol. Biol. 58, 329-333 (1996).
- Lizee, G. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
- Zhang, B. The significance of controlled conditions in lentiviral vector titration and in the use of multiplicity of infection (MOI) for predicting gene transfer events. Genet Vaccines Ther. 2, 6 (2004).
- Geran, R. I., Greenberg, N. H., MacDonald, M. M., Schumacher, A. M., Abbott, B. J. Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems. Cancer Chemother. Rep. 3, 1-103 (1972).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96, 23-28 (1990).
- Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors. Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).
- Rubinson, D. A. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nat Genet. 33, 401-406 (2003).
- Sui, G. Yin Yang 1 is a negative regulator of p53. Cell. 117, 859-872 (2004).
