DNA Vector-baseret RNA-interferens til Studieinformationen genfunktion i Cancer
Summary
RNA-interferens (RNAi) har mange fordele i forhold til gen-knockout og er bredt anvendt som et redskab i gen funktionelle undersøgelser. Opfindelsen af DNA-vektor baseret RNAi teknologi har gjort lang sigt og inducerbare gen knockdown muligt, og også øget muligheden for gen-nedregulering<em> In vivo</em>.
Abstract
RNA-interferens (RNAi) hæmmer genekspression ved specifikt at nedbryde target mRNA. Siden opdagelsen af dobbeltstrenget lille interferens RNA (siRNA) i gen-nedregulering 1 har RNAi blevet et stærkt forskningsværktøj i genfunktion undersøgelser. Sammenlignet med genetisk deletion har RNAi-medieret gen-nedregulering mange fordele, såsom lethed, hvormed den er udført og dets egnethed til de fleste cellelinjer. Flere undersøgelser har påvist anvendelser af RNAi teknologi i kræftforskning. Navnlig har udviklingen af DNA-vektor-baseret teknologi til at producere små hårnålen RNA (shRNA) drevet af U6 eller H1 promotor fremstillet langvarig og inducerbare gen-nedregulering muligt 2,3. Dets anvendelse i kombination med gensplejsede virusvektorer, såsom lentivirus, letter høje virkningsgrader af shRNA levering og / eller integration i genomisk DNA for stabil shRNA ekspression.
Beskriver vi en detailed under anvendelse af DNA-vektoren er baseret RNAi teknologi til at bestemme genfunktion, herunder konstruktion af lentivirale vektorer, der udtrykker shRNA, lentivirus produktion og celleinfektion, og funktionelle undersøgelser under anvendelse af en muse-xenotransplantat-model.
Forskellige strategier er blevet rapporteret at generere shRNA konstruktioner. Protokollen beskrevet her anvender PCR-amplifikation og en 3-fragment-ligering kan anvendes til direkte og effektivt at generere shRNA indeholdende lentivirale konstruktioner uden at efterlade nogen ekstra nukleotid støder op til en shRNA kodende sekvens. Idet shRNA-ekspressionskassetterne er skabt af denne strategi kan skæres ud af restriktionsenzymer, kan de let flyttes til andre vektorer med forskellige fluorescerende eller antibiotiske markører. De fleste kommercielle transfektionsreagenser kan anvendes i lentivirus produktionen. Men i denne rapport, giver vi en økonomisk metode ved hjælp af calciumphosphat nedbør, der kan opnå over 90% transfektionseffektivitet i293T-celler. Sammenlignet med konstitutive shRNA ekspressionsvektorer, en inducerbar shRNA system er især egnet til at vælte et gen afgørende for celleproliferation. Vi viser genet undertrykkelse af Yin Yang 1 (YY1), en potentiel oncogen i brystkræft 4,5, med en Tet-On inducerbare shRNA systemet og dets virkninger på tumordannelse. Forskning ved hjælp af lentivirus kræver gennemgang og godkendelse af en protokol om biosikkerhed ved biosikkerhed udvalget en forskers institution. Forskning ved hjælp af dyremodeller kræver gennemgang og godkendelse af et dyr protokol fra Animal Care og Use Committee (ACUC) af en forskers institution.
Protocol
Discussion
Denne protokol beskrives en metode til at vælte et gen under anvendelse shRNA og visualisere den biologiske virkning ved hjælp af bioluminescerende billeddannelse af tumorcellevækst in vivo. Målstedet for en shRNA bør ikke indeholde nogen af de tre restriktionssteder (BamHI, HindIII og EcoRI), der anvendes til subkloning. En sjælden scenario, når som helst af disse sites er til stede, kan en yderligere restriktionsenzym anvendes til at erstatte det i generering af konstruktionen.
<p class="jove_conte…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist støttet af de forskningsstipendiat Tilskud (116.403-RSG-09-082-01-MGO) fra American Cancer Society og Egne fonde for Wake Forest University Health Sciences til GS. DBS blev støttet af NCI træning tilskud 5T32CA079448.
Materials
In addition to common laboratory equipment used for RNA and protein analyses and cell culture, the following materials and reagents are required for this protocol.
| Name of the reagent |
| Biosafety Cabinet suitable for Biosafety Level 2 containment |
| PCR thermocycler |
| Ultracentrifuge |
| Anesthesia-induction chamber with isoflurane scavengers |
| Digital Vernier caliper |
| IVIS imaging system |
| Highly competent DH5a E. coli |
| EcoRI, BamHI, & HindIII restriction enzymes |
| T4 DNA Ligase |
| Third generation lentivirus packaging plasmids VSV-G, pRSV-Rev and pMDLg/pRRE |
Materials List
References
- Elbashir, S. M. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Sui, G. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553 (2002).
- Zhang, Q., Stovall, D. B., Inoue, K., Sui, G. The oncogenic role of Yin Yang 1. Crit. Rev. Oncog. 16, 163-197 (2011).
- Wan, M. Yin Yang 1 plays an essential role in breast cancer and negatively regulates p27. Am. J. Pathol. , (2012).
- Sui, G., Shi, Y. Gene silencing by a DNA vector-based RNAi technology. Methods in Molecular Biology. 309, 205-218 (2005).
- Trower, M. K. A rapid PCR-based colony screening protocol for cloned inserts. Methods Mol. Biol. 58, 329-333 (1996).
- Lizee, G. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
- Zhang, B. The significance of controlled conditions in lentiviral vector titration and in the use of multiplicity of infection (MOI) for predicting gene transfer events. Genet Vaccines Ther. 2, 6 (2004).
- Geran, R. I., Greenberg, N. H., MacDonald, M. M., Schumacher, A. M., Abbott, B. J. Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems. Cancer Chemother. Rep. 3, 1-103 (1972).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96, 23-28 (1990).
- Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors. Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).
- Rubinson, D. A. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nat Genet. 33, 401-406 (2003).
- Sui, G. Yin Yang 1 is a negative regulator of p53. Cell. 117, 859-872 (2004).
