תיאור מפורט של בידוד איון עכבר מתואר באמצעות הטכניקה של cannulation באתר הלבלב ductal וטפטוף של שילוב של מטוהר collagenase ופרוטאז הניטראלי.
חקירתו של ביטוי גנים בטא תא ותפקוד במבחנה השתנתה ישר לאורך השנים מהמחקר של שורות תאים סרטניים מכרסמים לחקר איונים מכרסמים מבודדים. איים עיקריים מציעים את היתרון הברור שהם יותר משקפים נאמנו את הביולוגיה של מסלולי איתות תאיים ותגובות הפרשה. ואילו בשיטה של בידוד איון באמצעות אנזים הכנות dissociating רקמות (TDE) כבר מבוססת היטב במעבדות רבות 1-4, וריאציות בעקביות של תפוקה ואיכות איון מכל זן מכרסמים ניתן להגביל את מידת ההיתכנות ומחקרי איון ראשוניים. וריאציות אלו מתרחשות לעתים קרובות כתוצאה מTDES הגולמי המטוהר חלקי המשמש בהליך בידוד האיון; TDES לעתים קרובות מפגינים הרבה וריאציות להרבה בפעילות ולעתים קרובות דורש התאמות למינון של אנזים בשימוש. מספר קטן של דיווחים השתמש מטוהר TDES לבידודים סלולריים מכרסמים 5, 6 </sup>, אבל בפועל הוא לא נפוץ למרות השימוש השגרתי ויתרונות של מטוהר TDES לבידודי איון אדם. בשיתוף פעולה עם VitaCyte, LLC (אינדיאנפוליס, אינדיאנה), פתח פרוטוקול שונה עכבר איון בידוד המבוסס על שתואר על ידי 7 Gotoh, 8, שבו הם TDES perfused ישירות לתוך צינור הלבלב של עכברים, ואחרי חלוקת רקמה גולמית באמצעות שיפוע Histopaque 9, ובידוד של איים מטוהרים. הבדל משמעותי בפרוטוקול שלנו הוא השימוש במטוהרי collagenase (CI האנזים הזה MA) ושילוב ניטראלי פרוטאז (CI האנזים הזה BP). Collagenase התאפיין בשימוש בקולגן פעילות assay 6 פלואורסצנטי המשפיל (CDA) שמנוצל סיבים מסיסים שבכותרתו fluorescently שוק עור כמצע 6. מצע זה יותר חזוי של קינטיקה של פירוק קולגן במטריקס הרקמות מכיוון שהוא מסתמך על קולגן יליד כמצע. פרוטאז הוא characterized עם assay הקינטית ניאון רגיש 10. ניצול משופרים מבחנים אלה, יחד עם ניתוח ביוכימי מסורתי יותר תאפשר TDE להיות מיוצר באופן עקבי יותר, מה שמוביל לביצועים משופר עקביות בין מגרשים. הפרוטוקול המתואר כאן היה מותאם לתשואה מקסימלי איון ומורפולוגיה איון אופטימלית באמצעות C57BL / 6 עכברים. במהלך הפיתוח של פרוטוקול זה, כמה שילובים של collagenase ופרוטאזות ניטראליות הוערכו בריכוזים שונים, והיחס הסופי של collagenase: פרוטאז ניטראלי 35:10 מייצג ביצועים דומים לסיגמה הסוג XI אנזים. בגלל השתנות משמעותית בתשואות איון ממוצעות מזנים שונים של חולדות ועכברים כבר דיווחה, שינויים נוספים בהרכב TDE צריכים להיעשות כדי לשפר את התפוקה והאיכות של איונים התאוששו ממינים וזנים שונים.
בפרוטוקול זה, יש לנו תארתי ההליך שלנו לcannulation, זלוף collagenase, והניתוק של הלבלב העכברי, במטרה לבודד את האיים לנגרהנס. מבחינה טכנית, בשיטה שלנו, שלט בפעם אחת, צריכה לאפשר לבידוד לבלב בתוך 4 דקות של הרדמת חסד בבעלי החיים ועל ידי 1 שעה צריכה לגרום לבידודה של איים מחיה אחת. המהירות של הטכניקה מאפשרת לנו לבודד מאיונים עד 12 עכברים בקטע אופייני, ובכך וכתוצאה מכך הבידוד של עד 3,000 איים.
בניגוד לפרוטוקולים אחרים המשתמשים בתכשירים גסים של collagenase, הפרוטוקול שלנו כולל את השימוש של פרוטאזות מטוהרות, CI האנזים הזה collagenase תואר שני וProtease BP CI האנזים הזה. סטיות בעקביות מהיערכות TDE כי הם זמינים מסחריים דורשות שכל מגרש להיבדק בנפרד ומותאם מראש לשימוש כללי. השתנות זו הרבה להרבה הובילה אותנו לשקול שימוש בפוריםTDES fied מVitaCyte. TDES אלה מטוהרים מאוד מתאפיינים במספר שיטות לרבות השימוש במבחני מצע רגישים פלואורסצנטי שכותרתו. Assay CDA פלואורסצנטי רגיש יותר לצורות מולקולריות שונות של collagenase כי יש קינטיקה שונה בקולגן הטבעי המשפיל. מבחני המצע פפטיד הסטוריים מספקים הערכה חסרה של collagenase. אפיון collagenase ידי מספר שיטות מבטיחה פעילות אנזים גדולה יותר בין מגרשים.
בהתבסס על הבדיקה בבית שלנו תוך שימוש במגוון של תכשירי collagenase הזמינים מסחרי, מצא כי שילובי אנזים מטוהרי ניב תוצאות לשעתק הרבה להרבה. היתרונות העיקריים של שימוש TDES מטוהר מאוד ומאופיין בקפדנות ביישום זה פעם אחת בהרכב האנזים האופטימלי מוגדרים, עקביות ביצועים הרבה להרבה מובטחת. עקביות זו מבטלת את תהליך העבודה האינטנסיבית של הסמכה הנדרשת בדרך כלל הרבהלמוצרי collagenase גולמי או מועשרים. TDES המטוהר גם לאפשר שינויים נוספים בהרכב על מנת לשפר את התפוקה והאיכות של איונים התאוששו מזנים שונים של עכברים. דיווח קומפוזיציות אנזים אופטימליות לבידוד של איים מזנים שונים של עכברים יכול להיות מועבר בצורה יעילה יותר. זה, בתורו, מוביל לשימוש יעיל יותר במשאבים וגמישות משופרת בעיצוב ניסיוני.
יש הרבה שלבים קריטיים שיכול להשפיע על התוצאה של בידודי איון באמצעות הפרוטוקול שלנו. הראשון הוא הצורך להשיג אינפלציה יעילה של הלבלב בטפטוף של הכנת האנזים. זה חשוב להתחיל אינפלציה בכוח עדין על המזרק, ולהגדיל את הכח כהתנפחות הלבלב. זה מועיל כדי להעביר את המעיים ולהרים את הלבלב באינפלציה כך שcollagenase perfuses כל האיברים. שלב קריטי נוסף הוא הכח שבעזרתו לוחץ הצינורות afteדגירת r על 37 מעלות צלזיוס (שלב 2.2). אנחנו גילינו שרועדים בלבלב קשה נגד הכובע של הצינור גורם לפיצול של איונים, אך ללא כל צורה של ניתוק מכאני בשלב זה, תשואות איון יכולות לנפול באופן דרמטי. זה גם הכרחי כי במהלך שלב הניתוק עם המזרק (שלב 2.5), כוח רמה בינונית מיושם במהלך התנועה מעלה ומטה עם הבוכנה; זה מבטיח ניתוק רקמות נאות לפני שלב הסינון (2.6), שבו מעט מאוד רקמה יש לשמור על מסנן מסננת התה. לבסוף, השלב האחרון הוא לעקוב בזהירות את שאיפתם של 20 המ"ל כל מהאיים המופרדים histopaque. למרות שאיים הם בדרך כלל בממשק של histopaque וHBSS, מצאתי שאנחנו מאבדים איונים כאשר אנו מנסים להסיר רק את הממשק, במקום זאת, אנחנו עכשיו להסיר את כל 20 המ"ל באמצעות נשא pipet מ"ל גדול 25. אנחנו הוספנו סינון דרך המסנן ההפוך 70 מיקרומטר (שלב 2.11) לבטל את הצורך לגentrifuge האיים שוב ושוב כדי לשטוף את histopaque.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי NIH R01 מענקי DK060581, R01 DK083583 (שניהם לRGM).
Name of Reagent | Company | Catalogue # | |||||||||
10X HBSS | Life Technologies | 14065 | |||||||||
RPMI | Fisher Scientific | 10-040 | |||||||||
BSA | Sigma Aldrich | any | |||||||||
Histopaque 1077 | Sigma Aldrich | 10771 | |||||||||
Histopaque 1119 | Sigma Aldrich | 11191 | |||||||||
4-0 Suture 100 yd roll | McKesson | 451521 | |||||||||
14 g blunt end needle | Fisher Scientific | 14-8216M | |||||||||
Vannas Superfine Sciss | Fisher Scientific | 501778 | |||||||||
Curved Spring Scissors | Fisher Scientific | 14127 | |||||||||
Curved Forceps (2) | Fisher Scientific | 15914G | |||||||||
Curved forceps (for 90 °) | Fine Science Tools | 11052-10 | |||||||||
27G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305109 | |||||||||
30G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305106 | |||||||||
PE tubing | Becton Dickinson | 427411 | |||||||||
Collagenase MA | Vitacyte, LLC | 001-2030 | |||||||||
BP Protease | Vitacyte, LLC | 003-1000 | |||||||||
3 ml syringe | Fisher Scientific | 309585 | |||||||||
30 ml syringe | Fisher Scientific | 309650 | |||||||||
70 μm filter | Fisher Scientific | 352350 | |||||||||
10 cm2 Petri Dish | Fisher Scientific | 351005 | |||||||||
Plastic tea strainer | Any kitchen supply | ||||||||||
Table 1. Reagents and Equipment | |||||||||||
|
|||||||||||
Table 2. Average islet yields (±SD) using different TDE lots* *Data represent average islet yields from at least 10 mice. Lot numbers in parentheses |