Konstant tryk-styret Ekstrudering fremgangsmåde til fremstilling af nano-størrelse lipidvesikler

Summary

Denne protokol beskrives en ekstrudering fremgangsmåde til fremstilling af lipidvesikler af sub-micron størrelser med en høj grad af homogenitet. Denne fremgangsmåde anvender en trykstyret system med kontrolleret nitrogen strømningshastigheder for liposompræparat. Lipid præparat^1,2 Vil liposom ekstrudering og størrelse karakterisering blive præsenteret heri.

Abstract

Liposomer er kunstigt fremstillet vesikler bestående af naturlige og syntetiske phospholipider, som er almindeligt anvendt som en cellemembran efterligner platform til at undersøge protein-protein og protein-lipid-interaktioner ^3, monitor drug delivery ^4,5, og indkapsling ^4. Phospholipider naturligt skabe buede lipiddobbeltlag, adskille sig fra en micelle. ⁶ Liposomer traditionelt klassificeres efter størrelse og antallet af dobbeltlag, dvs store unilamellare vesikler (LUV'er) og små unilamellære vesikler (SUV'er) og multilamellare vesikler (MLVer) ^7. Især er fremstillingen af homogene liposomer af forskellige størrelser vigtigt at studere membran krumning, der spiller en afgørende rolle i cellesignalering, endo-og exocytose, membranfusion, og protein handel ^8. Adskillige grupper analysere, hvordan proteiner anvendes til at modulere processer, der involverer membran krumning og derved fremstille liposomer med diametre under 100 – 400nm undersøge deres adfærd på cellefunktioner ^3. Andre fokuserer på liposom-medikamentindkapslingseffektivitet, studere liposomer som køretøjer til at gennemføre og levere et lægemiddel af interesse ^9. Drug indkapsling kan opnås som angivet under liposomdannelse ^9. Vores ekstruderingstrin bør ikke påvirke det indkapslede lægemiddel til to grunde bør nemlig (1) lægemiddelindkapsling opnås inden for dette trin og (2) liposomer bør bevare deres naturlige biofysiske stabilitet sikkert bærer lægemidlet i den vandige kerne. Disse forskningsmål yderligere antyder behovet for en optimeret fremgangsmåde til at designe stabile sub-micron lipidvesikler.

Ikke desto mindre har de nuværende liposompræparat teknologi (lydbehandling ^{10, fryse-og-optønings-10,} sedimentering) ikke tillader fremstilling af liposomer med stærkt krum overflade (dvs. diameter <100 nm) med høj konsistens og effektivitet ^10,5, hvilket begrænser biofysiske studier af en emerging området membran krumning sensorer. Heri, præsenteres en robust fremstillingsmetode til en række forskellige biologisk relevante liposomer.

Manuel ekstrudering med gastætte sprøjter og polycarbonatmembraner ^10,5 det er almindelig praksis, men heterogenitet ofte observeres ved anvendelse af porestørrelser under 100 nm på grund af grund af variationer af manuelt påført tryk. Vi anvendte en konstant trykstyret ekstruderingsapparat til fremstilling af syntetiske liposomer, hvis diametre ligger mellem 30 og 400 nm. Dynamisk lysspredning (DLS) ^10, elektronmikroskopi ¹¹ og nanopartikler sporing analyse (NTA) ¹² blev anvendt til kvantificering af liposomstørrelser som beskrevet i vor protokol med kommercielt polystyren (PS) perler, der anvendes som en kalibreringsstandard. En næsten lineær korrelation blev observeret mellem de anvendte porestørrelser og bestemmes eksperimentelt liposomer, hvilket indikerer high fidelity for vores trykstyret liposomfremstilling opfyldtHøder. Vi har desuden vist, at denne lipidvesikelpræparat metode er generelt anvendelig, uafhængigt af forskellige liposom størrelser. Endelig har vi også vist i en tidsforløbsundersøgelse at disse fremstillede liposomer var stabile i op til 16 timer. Et repræsentativt nanostørrelse liposompræparat protokol er vist nedenfor.

Protocol

1. Liposompræparatet Hent et 20 ml hætteglas med en Teflon-foret hætte. Rengør alle glasvarer og sprøjter med chloroform før brug for at forebygge forurening. Overfør 100 ul af reagenskvalitet chloroform til hætteglasset under anvendelse af en 250 ul lufttæt glassprøjte. Tilsættes 30 pi methanol af reagenskvalitet samme hætteglas under anvendelse af en 100 gl lufttæt glassprøjte. Til fremstilling af en 2 mM 7:1.5:1.5 phosphatidylcholin (POPC): phosphatidyl…

Discussion

Ved hjælp af Avestin Liposofast LF-50 ekstruder, vi vist, hvordan lille størrelse, er syntetiske liposomer fremstillet ved en tryk-styret system. Det er vigtigt at bemærke, at multilamellare vesikler dannes spontant efter liposom hydratisering, hvilket kan føre til produktion af små nanopartikler. Disse små multilamellare vesikler vil uundgåeligt strømme gennem det større polycarbonatmembran porestørrelse, hvilket heterogenitet i opløsninger af unilamellare vesikler fremstillet af et stort filter pore. Derfor…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Chloroform	Sigma-Aldrich	02432-25ML	95% stabilizers
High Grade Methanol	Sigma-Aldrich	179337-4L
Liposofast LF-50 Extruder	Avestin, Inc.
Phospholipids	Avanti Polar Lipids
Polycarbonate Pores	Avestin, Inc.		25 mm diameter
Drain discs PE	Avestin, Inc.	230600	25 mm diameter