Constant Pressure-gecontroleerde Extrusie werkwijze voor de bereiding van Nano-sized lipide bolletjes
Summary
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het bereiden extrusie lipide vesicles van sub-micron afmetingen met een hoge mate van homogeniteit. Deze methode maakt gebruik van een druk-gecontroleerd systeem met gecontroleerde stikstofstroom tarieven voor liposoom voorbereiding. De lipide voorbereiding<sup> 1,2</sup>, Zal liposoom extrusie, en de grootte karakterisering hierin worden gepresenteerd.
Abstract
Liposomen zijn kunstmatig bereid vesicles bestaande uit natuurlijke en synthetische fosfolipiden die algemeen gebruikt worden als membraan nabootsen platform eiwit-en eiwit-interacties lipide 3 beeldscherm drug delivery 4,5 en inkapseling 4 bestuderen. Fosfolipiden van nature te creëren gebogen lipidendubbellagen onderscheiden zich van een micel. 6 Liposomen worden traditioneel ingedeeld naar grootte en het aantal dubbellagen, dat wil zeggen grote unilamellaire blaasjes (LUVS), kleine unilamellaire blaasjes (SUV's) en multilamellaire blaasjes (MLV's) 7. Met name de bereiding van homogene liposomen van verschillende grootte is van belang voor het bestuderen membraan kromming die een belangrijke rol speelt bij celsignalering, endo-en exocytose, membraanfusie en eiwit handel 8. Verscheidene groepen gaan hoe eiwitten gebruikt voor het moduleren processen membraan kromming omvat en dus bereiden liposomen diameters <100-400nm tot hun gedrag op de mobiele functies 3 te bestuderen. Anderen richten zich op liposoom-drug inkapseling, het bestuderen van liposomen als dragers voor het uitvoeren en leveren een geneesmiddel van belang 9. Drug inkapseling kan worden bereikt, zoals gerapporteerd tijdens de vorming van liposomen 9. De extrusie niet de ingekapseld geneesmiddel beïnvloeden om twee redenen, dat wil zeggen dat (1) geneesmiddel inkapseling voorafgaand verwezenlijkt deze stap (2) liposomen moeten hun natuurlijke biofysische stabiliteit behouden, stevig die het geneesmiddel in de waterige kern. Deze onderzoeksdoelstellingen verder wijzen op de noodzaak voor een optimale manier van stabiele sub-micron lipide vesicles ontwerpen.
Toch maar met de huidige liposoombereiding technologieën (sonicatie 10, vries-en dooi-10, sedimentatie) niet toe dat de voorbereiding van liposomen met een sterk gebogen oppervlak (dat wil zeggen een diameter van <100 nm) met een hoge consistentie en efficiëntie 10,5, die de biofysische grenzen studies van een emerging gebied van membraan kromming sensing. Hierin stellen we een robuuste bereidingswijze voor een verscheidenheid van biologisch relevante liposomen.
Handmatig met behulp van extrusie gasdichte spuiten en polycarbonaat membranen 10,5 is een veel voorkomende praktijk, maar heterogeniteit wordt vaak waargenomen bij het gebruik van poriegrootte <100 nm als gevolg van de variabiliteit van de toegepaste manuele druk. We gebruikten een constante druk gecontroleerde extrusieinrichting synthetische liposomen die diameters variëren tussen 30 en 400 nm te bereiden. Dynamische lichtverstrooiing (DLS) 10, elektronenmicroscopie 11 en nanodeeltjes tracking analyse (NTA) 12 werden gebruikt om de afmetingen liposoom kwantificeren beschreven in onze protocol met commerciële polystyreen (PS) korrels als kalibratiestandaard. Een bijna-lineaire correlatie werd gevonden tussen de werknemers poriegrootte en de experimenteel bepaalde liposomen, met vermelding van high fidelity van onze druk-gecontroleerde liposoombereiding voldaanHod. Voorts hebben we aangetoond dat deze lipidesamenstelling bereidingswijze is algemeen toepasbaar, onafhankelijk van verschillende afmetingen liposoom. Tot slot hebben we ook aangetoond in een tijdsverloop studie dat deze voorbereid liposomen stabiel waren voor maximaal 16 uur. Een representatieve nanoformaat liposoompreparaat protocol wordt hierna aangetoond.
Protocol
Discussion
Met behulp van de Avestin Liposofast LF-50 Extruder, hebben we laten zien hoe de kleine, synthetische liposomen zijn bereid door middel van een druk-gestuurd systeem. Het is belangrijk op te merken dat multilamellaire blaasjes spontaan te vormen naar aanleiding liposoom hydratatie, wat kan leiden tot productie van kleinere nanodeeltjes. Deze kleine multilamellaire blaasjes zal onvermijdelijk stromen door de grotere polycarbonaat membraan poriën, waardoor de heterogeniteit in oplossingen van unilamellaire blaasjes die d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Collaborative Innovation Award. LAM werd gesteund door de Signalering en Cellulaire verordening National Institute of Health opleiding subsidie (T32 GM008759) en de NIH Ruth L. Kirschstein Pre-doctoraal onderzoeker (CA165349-01). We willen graag prof. Michael Stowell (CU Boulder), prof. dr. Douglas Rees en prof. dr. Rob Phillips (Caltech) bedanken voor hun waardevolle commentaar.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 02432-25ML | 95% stabilizers |
| High Grade Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | |
| Liposofast LF-50 Extruder | Avestin, Inc. | ||
| Phospholipids | Avanti Polar Lipids | ||
| Polycarbonate Pores | Avestin, Inc. | 25 mm diameter | |
| Drain discs PE | Avestin, Inc. | 230600 | 25 mm diameter |
References
- Connor, J., Bucana, C., Fidler, I. J., Schroit, A. J. Differentiation-dependent expression of phosphatidylserine in mammalian plasma membranes: quantitative assessment of outer-leaflet lipid by prothrombinase complex formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3184-3188 (1989).
- Smith, S. A., Morrissey, J. H. Rapid and efficient incorporation of tissue factor into liposomes. J. Thromb. Haemost. 2, 1155-1162 (2004).
- Hui, E., Johnson, C. P., Yao, J., Dunning, F. M., Chapman, E. R. Synaptotagmin-mediated bending of the target membrane is a critical step in Ca(2+)-regulated fusion. Cell. 138, 709-721 (2009).
- Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes. J. Immunol. Methods. 132, 25-35 (1990).
- Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. Extrusion technique to generate liposomes of defined size. Methods Enzymol. 367, 3-14 (2003).
- Gruner, S. M., Cullis, P. R., Hope, M. J., Tilcock, C. P. Lipid polymorphism: the molecular basis of nonbilayer phases. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 14, 211-238 (1985).
- Guven, A., Ortiz, M., Constanti, M., O’Sullivan, C. K. Rapid and efficient method for the size separation of homogeneous fluorescein-encapsulating liposomes. J. Liposome. Res. 19, 148-154 (2009).
- Zimmerberg, J., Kozlov, M. How proteins produce cellular membrane curvature. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 9-19 (2006).
- Chonn, A., Cullis, P. R. Recent advances in liposomal drug-delivery systems. Curr. Opin. Biotechnol. 6, 698-708 (1995).
- Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochim. Biophys. Acta. 858, 161-168 (1986).
- Matsuoka, K., Schekman, R. The use of liposomes to study COPII- and COPI-coated vesicle formation and membrane protein sorting. Methods. 20, 417-428 (2001).
- Dragovic, R. A., Gardiner, C., Brooks, A. S., Tannetta, D. S., Ferguson, D., Hole, P., Carr, B., Redman, C., Harris, A. L., Dobson, P. J., Harrison, P., Sargent, I. L. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. , (2011).
- Hunter, D. G., Frisken, B. J. Effect of extrusion pressure and lipid properties on the size and polydispersity of lipid vesicles. Biophys J. 74, 2996-3002 (1998).
