تصنيع واستخدام ميكروأرس المكروية (MEArrays)
Summary
ووصف وظيفي اندماجي طريقة الفرز من أجل الحصول على نظرة ثاقبة لآثار التركيب الجزيئي للmicroenvironments على الوظائف الخلوية. الأسلوب يستفيد من التكنولوجيات القائمة على أساس ميكروأري لتوليد صفائف microenvironments اندماجي تعريف التي تدعم التصاق الخلايا والتحليل الوظيفي.
Abstract
التفاعلات بين الخلايا والمكروية المحيطة بها تكون له عواقب وظيفية للسلوك الخلوية. على مستوى خلية واحدة، يمكن microenvironments متميزة فرض التمايز، والهجرة، وانتشار الظواهر، وعلى مستوى أنسجة المكروية العمليات المعقدة مثل التشكل وتكون الأورام 1. ليس فقط محتويات الخلية والجزيئية لتأثير microenvironments الخلايا داخل، ولكن القيام بذلك مرونة 2 و 3 من هندسة الأنسجة. يعرف بأنه مجموع خلية خلية، ECM-، والتي تذوب في التفاعلات عامل، بالإضافة إلى الخصائص الفيزيائية، والمكروية معقدة. والظواهر من الخلايا داخل الأنسجة ويرجع ذلك جزئيا إلى محتواها الجيني ويرجع ذلك جزئيا إلى التفاعلات اندماجي مع microenviroment. ومن التحديات الرئيسية هو ربط مجموعات محددة من مكونات microenvironmental مع السلوكيات المميزة.
الأنف والحنجرة "> وهنا، نقدم المكروية ميكروأري (MEArray) منهاج خلية مقرها الفرز وظيفية من التفاعل مع microenvironments اندماجي 4. طريقة تسمح للسيطرة في وقت واحد من التركيب الجزيئي ومعامل المرونة، ويجمع بين استخدام ميكروأري على نطاق واسع تقنيات micropatterning و. شاشات MEArray تتطلب عدد قليل من إلى 10،000 خلية لكل مجموعة، مما يسهل الدراسات الفنية للأنواع الخلايا نادرة مثل الخلايا الاصلية الكبار. وجود قيود على التكنولوجيا التي لا microenvironments الأنسجة كامل تلخيصها بشكل كامل على MEArrays. ومع ذلك، مقارنة الردود في نوع من الخلايا نفس microenvironments العديدة ذات الصلة، على سبيل المثال سوف تركيبات البشرى للبروتينات ECM التي تميز نسيج معين، يعطي فكرة عن كيفية حصول microenvironmental مكونات الأنسجة محددة الظواهر الفنية.يمكن طباعة MEArrays باستخدام مجموعة متنوعة واسعة من المؤتلف غرووث العوامل، السيتوكينات، والبروتينات تنقية ECM، وخليط منها. يقتصر فقط منصة توفر الكواشف محددة. MEArrays قابلة للتحليل الوقت انقضى، ولكن في معظم الأحيان تستخدم لتحليل نقطة النهاية من الوظائف الخلوية التي هي قابلة للقياس مع تحقيقات الفلورسنت. على سبيل المثال، عادة يتم قياس توليف الحمض النووي، موت الخلايا المبرمج، واقتناء الدول المتباينة، أو إنتاج منتجات جين معين. لفترة وجيزة، وتدفق الأساسية للتجربة MEArray هو إعداد الشرائح المغلفة مع الطبقات التحتية الطباعة وإعداد لوحة رئيسية من البروتينات التي سيتم طباعتها. ثم يتم طباعة المصفوفات مع الروبوت ميكروأري، يسمح لخلايا إرفاق، وتنمو في الثقافة، ومن ثم يتم إصلاحها كيميائيا عند الوصول إلى نقطة النهاية التجريبية. وتستخدم المقايسات الفلورسنت أو اللونية، مع تصوير المجاهر التقليدية أو الماسحات الضوئية ميكروأري، لتكشف الظواهر ذات الصلة الجزيئية والخلوية (الشكل 1).
Protocol
Discussion
طريقة MEArray المقدمة هنا يمكن التحليلات الفنية للخلية والتفاعلات المكروية اندماجي 4. MEArray تحليل يجمع بين استخدام تكنولوجيات micropatterning الأساسية، بيولوجيا الخلايا، والروبوتات وأجهزة الطباعة ميكروأري التحليل التي تتوفر في مرافق متعددة كثيرة. شاشات MEArray متوافقة مع م…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم من قبل ML NIA (R00AG033176 وR01AG040081) ومختبر البحوث الموجهة والتنمية، وزارة الطاقة عقد # DE-AC02-05CH11231.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| Glass slides 25 mm x 75 mm | VWR | 48311-600 | |
| Glass coverslips (no.1) 24 mm x 50 mm | VWR | 48393-241 | |
| Staining dish (or Coplan jar) | VWR | 25461-003 | |
| Petri dishes (15 cm) | BD Falcon | 351058 | |
| NaOH (1.0N) | Sigma-Aldrich | S2567 | |
| APES (>98% (3-Aminopropyl)triethoxysilane) | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G7651 | 50% in water |
| APS (>98% Ammonium Persulfate) | Sigma-Aldrich | A3678 | Prepare 10% working solution with ddH2O |
| TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Acrylamide (40%) | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| Bis-Acrylamide (2% w/v) | Fisher BioReagents | BP1404-250 | |
| 0.45 μm Syringe filter 4-mm nylon | Nalgene | 176-0045 | |
| FITC | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Elastomer kit via Ellsworth Adhesives |
| 2-chamber slides | NUNC | 177380 | |
| Pluronic F108 | BASF | 30089186 | |
| Aquarium sealant | Dow Corning | DAP 00688 | |
| Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Disposable plastic cups | |||
| Tongue depressors | |||
| Nitrile gloves | |||
| Plastic microscope slide boxes | |||
| Spin coater | WS-400B-6NPP/LITE | Laurell Technologies Corporation | |
| Oven | |||
| Digital hotplate | |||
| 384-well plates | A brand appropriate for the microarray robot | ||
| Microarray printing robot | |||
| Inverted phase and fluorescence microscope | |||
| Axon microarray scanners | Molecular Devices | Multiple configurations exist |
References
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
- LaBarge, M. A. Human mammary progenitor cell fate decsions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology. 1, 70-79 (2009).
- Kim, H. N. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Annals of biomedical engineering. , (2012).
- Boudou, T., Ohayon, J., Picart, C., Pettigrew, R. I., Tracqui, P. Nonlinear elastic properties of polyacrylamide gels: implications for quantification of cellular forces. Biorheology. 46, 191-205 (2009).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology. Chapter 10, Unit 10 (2010).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat. Methods. 2, 119-125 (2005).
- Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments. Mol. Syst. Biol. 2, 37 (2006).
