Fabricage en gebruik van micro-omgeving microarrays (MEArrays)
Summary
Een combinatorische functionele screening methode voor het verkrijgen van inzicht in de effecten van de moleculaire samenstelling van micro-omgevingen op cellulaire functies beschreven. De methode maakt gebruik van bestaande micro-array gebaseerde technologieën voor het genereren van arrays van gedefinieerde combinatorische micro-omgevingen die ondersteuning bieden voor celadhesie en functionele analyse.
Abstract
De interacties tussen cellen en hun omgeving micro-omgeving hebben functionele gevolgen voor cellulaire gedrag. Op enkele cel kunnen verschillende micro-omgevingen opleggen differentiatie, migratie en proliferatie fenotypes en op weefselniveau de micro verwerkt complex als morfogenese en tumorigenese 1. Niet alleen de cel en moleculaire inhoud van micro-omgevingen invloed hebben op de cellen binnen, maar dat doen de elasticiteit 2 en geometrie 3 van het weefsel. Gedefinieerd als de som van cel-cel-ECM en oplosbare factor interacties, in aanvulling op fysieke kenmerken, is het micro complex. Het fenotype van cellen in een weefsel gedeeltelijk vanwege hun genomische inhoud en mede door de combinatorische interacties met de microenviroment. Een belangrijke uitdaging is om specifieke combinaties van microenvironmental componenten verbinden met onderscheidende gedrag.
ent "> Hier geven we de micro microarray (MEArray) platform voor cel-gebaseerde functionele screening van combinatorische interactie met micro-omgevingen 4. Werkwijze maakt gelijktijdig regelen van de moleculaire samenstelling en de elastische modulus, en combineert de van veelgebruikte microarray en micropatterning technologieën. MEArray schermen moet zo weinig 10.000 cellen per array, welke functionele studies van zeldzame celtypen zoals volwassen stamcellen vergemakkelijkt. Een beperking van de technologie is dat gehele weefsel micromilieus niet volledig worden samengevat op MEArrays. Uit een vergelijking van reacties in hetzelfde celtype talrijke verwante micromilieus bijvoorbeeld paarsgewijze combinaties van ECM eiwitten die een bepaald weefsel karakteriseren zal inzicht in hoe microenvironmental componenten opwekken weefselspecifieke functionele fenotypes.MEArrays kunnen worden afgedrukt met een groot aantal recombinant growth factoren, cytokines en gezuiverde ECM eiwitten en combinaties daarvan. Het platform wordt alleen beperkt door de beschikbaarheid van specifieke reagentia. MEArrays vatbaar zijn voor time-lapsed analyse, maar meestal worden gebruikt voor eindpunt analyse van cellulaire functies die meetbaar met fluorescerende probes. Zo worden DNA synthese, apoptose, verwerving van gedifferentieerde toestanden of productie van specifieke genproducten gewoonlijk gemeten. Kort de basis luchtstroom van een MEArray experiment is bekleed met dia afdrukken substraat te bereiden en de masterplaat van eiwitten die moeten worden afgedrukt bereiden. Dan de arrays zijn bedrukt met een microarray robot worden cellen mogen hechten, in cultuur groeien en vervolgens chemisch gefixeerd bij het bereiken van de experimentele eindpunt. Fluorescerende of colorimetrische testen, afgebeeld met traditionele microscopen of microarray scanners, gebruikt om relevante moleculaire en cellulaire fenotypes (figuur 1) tonen.
Protocol
Discussion
De MEArray methode hier gepresenteerde maakt functionele analyses van cel-en combinatorische micro-omgeving interacties 4. MEArray analyse combineert het gebruik van elementaire micropatterning technologieën, celbiologie, en microarray afdrukken robots en analyse apparaten die beschikbaar zijn in een groot aantal multi-user faciliteiten. MEArray schermen zijn compatibel met de meeste hechtende celtypen, maar serumvrije media formuleringen kunnen aangepast worden in sommige gevallen BSA of <1% serum, die k…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ML wordt ondersteund door de NIA (R00AG033176 en R01AG040081) en door Laboratorium Gerichte Research and Development, US Department of Energy contract # DE-AC02-05CH11231.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| Glass slides 25 mm x 75 mm | VWR | 48311-600 | |
| Glass coverslips (no.1) 24 mm x 50 mm | VWR | 48393-241 | |
| Staining dish (or Coplan jar) | VWR | 25461-003 | |
| Petri dishes (15 cm) | BD Falcon | 351058 | |
| NaOH (1.0N) | Sigma-Aldrich | S2567 | |
| APES (>98% (3-Aminopropyl)triethoxysilane) | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G7651 | 50% in water |
| APS (>98% Ammonium Persulfate) | Sigma-Aldrich | A3678 | Prepare 10% working solution with ddH2O |
| TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Acrylamide (40%) | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| Bis-Acrylamide (2% w/v) | Fisher BioReagents | BP1404-250 | |
| 0.45 μm Syringe filter 4-mm nylon | Nalgene | 176-0045 | |
| FITC | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Elastomer kit via Ellsworth Adhesives |
| 2-chamber slides | NUNC | 177380 | |
| Pluronic F108 | BASF | 30089186 | |
| Aquarium sealant | Dow Corning | DAP 00688 | |
| Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Disposable plastic cups | |||
| Tongue depressors | |||
| Nitrile gloves | |||
| Plastic microscope slide boxes | |||
| Spin coater | WS-400B-6NPP/LITE | Laurell Technologies Corporation | |
| Oven | |||
| Digital hotplate | |||
| 384-well plates | A brand appropriate for the microarray robot | ||
| Microarray printing robot | |||
| Inverted phase and fluorescence microscope | |||
| Axon microarray scanners | Molecular Devices | Multiple configurations exist |
References
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
- LaBarge, M. A. Human mammary progenitor cell fate decsions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology. 1, 70-79 (2009).
- Kim, H. N. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Annals of biomedical engineering. , (2012).
- Boudou, T., Ohayon, J., Picart, C., Pettigrew, R. I., Tracqui, P. Nonlinear elastic properties of polyacrylamide gels: implications for quantification of cellular forces. Biorheology. 46, 191-205 (2009).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology. Chapter 10, Unit 10 (2010).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat. Methods. 2, 119-125 (2005).
- Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments. Mol. Syst. Biol. 2, 37 (2006).
