Kvantitativ Real-time Analysis of Base excision reparation aktivitet i cellysat Produkten bygger på sårspecifik Molecular Beacons
Summary
Vi beskriver en metod för kvantitativ realtids-mätning av DNA glykosylas och AP verksamheten endonukleas i cellnukleära lysat. Analysen ger hastigheter av DNA-reparation aktivitet som lämpar sig för kinetisk analys och är anpassningsbar för kvantifiering av DNA-reparation aktivitet i vävnad och lysat tumör eller med renade proteiner.
Abstract
Vi beskriver en metod för kvantitativ realtids-mätning av DNA glykosylas och AP verksamheten endonukleas i cellnukleära lysaten med bas excision reparation (BER) molekylära fyrar. Substratet (signal) består av en deoxioligonukleotid med en enda bas lesion med en 6-karboxifluorescein (6-FAM) grupp konjugerad till 5'-änden och en Dabcyl grupp konjugerad till 3'-änden av oligonukleotiden. BER molekylära fyren är 43 baser i längd och sekvensen är utformad för att gynna bildandet av en stam-loop struktur med 13 nukleotider i slingan och 15 baspar i stammen 1,2. När den är hopfälld i denna konfiguration 6-FAM-delen avbryts genom Dabcyl i en icke-fluorescerande sätt via Förster-energiöverföring (FRET) 3,4. Lesionen är placerad så att efter avlägsnande bas lesion och strängen klyvning återstående 5 bas oligonukleotid innehållande 6-FAM-delen frigörs från skaftet. Släpp ennd avskildhet från släckningsenheten (Dabcyl) resulterar i en ökning av fluorescens som står i proportion till nivån på DNA-reparation. Genom att samla flera läser av fluorescens värden är i realtid bedömning av BER verksamheten möjlig. Användningen av standard kvantitativ realtids-PCR-instrument medger samtidig analys av flera prov. Utformningen av dessa BER molekylära fyrar, med en enda bas lesion, är mottaglig för kinetiska analyser, BER kvantifiering och hämmare validering och är anpassningsbar för kvantifiering av DNA-reparation aktivitet i vävnader och tumör cellysater eller med renad proteiner. Analysen av gruppundantagsförordningen aktivitet i tumör lysat eller vävnad aspirerar som använder dessa molekylära fyrar kan vara tillämpliga på funktionella biomarkör mätningar. Vidare tillhandahåller analys av BER aktivitet med renade proteiner med användning av denna kvantitativ analys en snabb, högeffektiv metod för upptäckt och validering av BER-inhibitorer.
Protocol
Discussion
Det finns över 600 citat använder termen "molekylära ledstjärna" för att upptäcka och kvantifiera många molekyler och enzymatiska aktiviteter, inklusive helikasaktivitet 6, DNA-polymeras aktivitet 7,8, DNA-ligas aktivitet 9, telomerasaktivitet 10, DNA photolyase aktivitet 11 och DNA / RNA-hybrider 12, bland många andra. Förutom användningen av molekylära fyrar för mätning av de aktiviteter DNA-reparation som anges ovan, har vi och a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats med bidrag från Pittsburgh Foundation och National Institutes of Health (NIH) [GM087798, CA148629, ES019498] för att RWS. Stöd för UPCl Lentiviral Facility lämnades till RWS genom Cancer Support Grant från National Institutes of Health [P30 CA047904]. Stöd gavs också av University of Pittsburgh Institutionen för farmakologi och kemisk biologi DS. Stöd gavs också av ESTRO till CV.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | Molecular grade |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | Molecular grade |
| DTT | Fisher | BP172-5 | |
| HEPES- Solution | Invitrogen | 15630 | |
| HEPES-Salt | Sigma | H4034-500G | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 17-8 | |
| 0.22μM filter | Nalgene | 167-0020 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Products | Pierce | 66373 | MW 7000 |
| Syringe | Fisher | 309659 | |
| Needle | Fisher | 305196 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Black |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher | 352097 | |
| NucBuster Protein Extraction Kit | Calbiochem | 71183 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Molecular Beacons | IDT | ||
| BioRad Protein assay dye reagent concentrate | BioRad | Cat# 500-0006 |
References
- Mutamba, J. T. XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide. DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).
- Tang, J. B. N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide. Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).
- Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes. Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).
- Kreklau, E. L. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).
- Belon, C. A., Frick, D. N. Monitoring helicase activity with molecular beacons. BioTechniques. 45, 433-442 (2008).
- Ma, C. Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon. Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).
- Summerer, D., Marx, A. A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).
- Liu, L. Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase. The Analyst. 130, 350-357 (2005).
- Xiao, Y. Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity. J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).
- Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).
- Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).
- Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon. Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).
- Mirbahai, L. Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells. DNA Repair (Amst). , (2009).
- Maksimenko, A. A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).
