Lezyon özgü Moleküler Beacon kullanılması Hücre lizatları ve Base Eksizyon Onarımı Faaliyet kantitatif, gerçek zamanlı Analizi
Summary
Biz DNA glikozilaz ve hücre nükleer lizatları AP endonükleaz faaliyetlerinin kantitatif, gerçek zamanlı ölçümü için bir metodu tanımlar. Tahlil kinetik analiz mükellef DNA Onarım faaliyet oranları verir ve doku ve tümör lizatları veya saflaştırılmış proteinler ile DNA tamir aktivitesinin ölçümü için uyarlanabilir.
Abstract
Biz baz eksizyon tamiri (BER) moleküler işaretleri kullanarak DNA glikozilaz ve hücre nükleer lizatları AP endonükleaz faaliyetlerinin kantitatif, gerçek zamanlı ölçümü için bir metodu tanımlar. Substrat (işaret) bir 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) 5'end ve oligonükleotic'ten 3 'ucuna bir konjuge Dabcyl yarımına konjuge yarımı ile birlikte, tek bir baz ihtiva eden bir lezyonun deoxyoligonucleotide oluşur. BER moleküler işaret uzunluğu 43 bazlar ve sekansı kök 1,2 in halkası ve 15 baz çifti olarak 13 nükleotid ile birlikte bir kök döngülü yapısının oluşumunu teşvik etmek için tasarlanmıştır. Bu yapılandırmada, katlandığında 6-FAM yarımına Förster Rezonans enerji transferi (FRET) 3,4 yoluyla bir floresan olmayan bir şekilde Dabcyl ile söndürülmüştür. Lezyon 6-FAM parçası içeren kalan 5 baz oligonükleotid kök salınan şekilde aşağıdaki temel lezyon kaldırma ve iplik kesme konumlandırılmış. Bir serbest bırakınDNA onarım seviyesine orantılı floresans bir artış quencher (Dabcyl) sonuçları nd dekolmanı. Birden fazla toplayarak floresans değerlerinin okur, BER aktivitesinin gerçek zamanlı değerlendirmesi mümkündür. Standart kantitatif gerçek zamanlı PCR araçların kullanılması çok sayıda örnekleri arasında eşzamanlı analiz sağlar. Bu BER moleküler işaretlerinin tasarım, tek bir baz lezyonu olan, kinetik analizleri, BER ölçümü ve inhibitörü doğrulama mükellef ve doku ve tümör hücre lizatları DNA tamir aktivitesinin ölçümü için veya protein saflaştırılmış ile uyumludur. Bu moleküler işaretleri kullanarak tümör lizatları veya doku aspiratlarında BER faaliyet analizi fonksiyonel biyomarker ölçümü için geçerli olabilir. Dahası, bu niceliksel deneyi kullanılarak proteinleri ile saflaştırılmış BER aktivitesinin analizi BER inhibitörlerinin keşfi ve doğrulama için hızlı, yüksek verim bir yöntem sağlar.
Protocol
Discussion
Birçok molekül ve helikaz etkinliği 6, DNA polimeraz aktivitesi 7,8, DNA ligaz aktivitesi 9, telomeraz aktivitesi 10, DNA fotolizaz aktivitesi 11 ve DNA / dahil enzimatik faaliyetleri, tespit ve ölçülmesi için dönem 'moleküler feneri' kullanarak 600 alıntılar üzerinde bulunmaktadır diğerleri arasında melez 12, RNA. Yukarıda listelenen DNA onarım faaliyetlerinin ölçümü için moleküler işaretçileri kullanımı yanı sıra, bu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RWS Bu çalışma Pittsburgh Vakfı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) [;; CA148629 ES019498 GM087798] hibe ile desteklenmiştir. UPCI lentiviral Tesis desteği Ulusal Sağlık Enstitüleri Kanser Merkezi Destek Hibe tarafından RWS sağlanmıştır [P30 CA047904]. Destek aynı zamanda Pittsburgh Üniversitesi Farmakoloji Anabilim Dalı & DS Kimya Biyoloji tarafından sağlandı. Destek de CV Estro tarafından sağlandı.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | Molecular grade |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | Molecular grade |
| DTT | Fisher | BP172-5 | |
| HEPES- Solution | Invitrogen | 15630 | |
| HEPES-Salt | Sigma | H4034-500G | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 17-8 | |
| 0.22μM filter | Nalgene | 167-0020 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Products | Pierce | 66373 | MW 7000 |
| Syringe | Fisher | 309659 | |
| Needle | Fisher | 305196 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Black |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher | 352097 | |
| NucBuster Protein Extraction Kit | Calbiochem | 71183 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Molecular Beacons | IDT | ||
| BioRad Protein assay dye reagent concentrate | BioRad | Cat# 500-0006 |
References
- Mutamba, J. T. XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide. DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).
- Tang, J. B. N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide. Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).
- Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes. Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).
- Kreklau, E. L. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).
- Belon, C. A., Frick, D. N. Monitoring helicase activity with molecular beacons. BioTechniques. 45, 433-442 (2008).
- Ma, C. Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon. Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).
- Summerer, D., Marx, A. A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).
- Liu, L. Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase. The Analyst. 130, 350-357 (2005).
- Xiao, Y. Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity. J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).
- Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).
- Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).
- Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon. Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).
- Mirbahai, L. Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells. DNA Repair (Amst). , (2009).
- Maksimenko, A. A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).
