Substantia Nigra 및 복부 Tegmental 지역의 도파민 규정의 종합적인 프로파일

Summary

도파민은 분명히 세포 기관 및 도파민 뉴런의 dendrites을 포함 midbrain의 핵에서 규제하고 있습니다. 여기 substantia nigra (SN)과 설치류의 복부 tegmental 지역 (VTA)의 midbrain의 핵에 도파민 규정에 따라서 절개 및 샘플 처리 결과를 극대화하는 접근 방식과 결론 및 통찰력을 설명합니다.

Abstract

도파민은 CNS에 적극적으로 공부 신경 전달 물질이다. 사실, 전위의 활동 및 보상 관련 행동의 개입은 도파민 조절과 관련된 분자 결함으로 문의 50 여년간을 육성하고있다. nigrostriatal 및 mesoaccumbens 경로의 터미널 필드 지역의 규제에 대한 분자 기초시 뇌 초점에서 도파민 규제 이러한 질문의 대부분은, striatum과 핵의 accumbens. 또한, 이러한 연구는 서부 유럽 표준시 조직 무게로 정상화와 도파민 조직 내용의 분석을 집중하고 있습니다. 같은 티로신 hydroxylase (TH) 단백질 번째 인산화, 도파민 수송 (DAT) 및 기공을 갖는 모노 아민 전송기 2 (VMAT2) 단백질로, 도파민 조절 단백질의 조사는 종종 동일한 예제에서 도파민 조직 내용의 분석에 포함되지 않습니다. 도파민 조직 내용과 그 조절 단백질 (POST-tra를 포함하여 모두를 분석할 수있는 능력nslational 수정)은 단백질 수준과 TH, DAT, 또는 VMAT2의 기능과 도파민의 관계를 해석에 내재된 능력을 제공, 또한 샘플 경제를 확장뿐만 아니라. 아직은 적은 비용,로이 번역은 수사관 '선택의 거의 모든 패러다임에서 도파민의 분자 조절에 대한 식견을 생산하고 있습니다.

우리는 midbrain에 분석을 집중. SN 및 VTA는 일반적으로 도파민 규제 대부분의 연구에서 소홀히하고 있지만, 이러한 핵 쉽게 실천으로 해부한다. 종합 도파민 조직 컨텐츠와 TH의 판독, DAT, 또는 VMAT2가 실시됩니다. 이 행위에 대한 SN 및 VTA의 도파민 기능의 영향에 문학 급성장, 그리고 그 안에 ^1-5 외인성 물질 또는 질병 프로세스의 impingements있다. 또한, 이러한 성장 요인과 같은 화합물은 SN 또는 VTA에서 비교적 큰 범위까지, 도파민과 도파민 조절 단백질에 지대한 영향을 미칠 <sup> 6-8. 따라서이 방법은 특정 치료 행태 및 도파민 조절을 조절하는 방법에 자신의 질문을 연장하려는 실험실에 대한 참조용으로 제공됩니다. 자, 다단계 방식은 도파민 조직 내용의 분석, TH의 단백질 수준, DAT, 또는 VMAT2, 그리고 쥐 midbrain의 substantia nigra 및 VTA의 TH의 인산화 위해 제공됩니다. 회 인산화의 분석뿐만 아니라 번째 활동 규제하는 방법뿐만 아니라, 주어진 패러다임의 somatodendritic 핵에 영향 신호 폭포에 상당한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

우리는이 두 핵 각각의 핵 (그림 1) 특정 생체내에서 도파민 규정의 분자 메커니즘을 공개 프로필을 생산하고 해부 조직의 샘플 처리를 분리하는 해부의 기술을 설명합니다.

Protocol

1. 해부 축축한 얼음 침대에서 쥐 두뇌 매트릭스 (코로나 부분은 떨어져 1mm를 차별), 5 면도칼이 들어있는 배양 접시, 그리고 # 11 메스를 진정 하라구. 별도의 용기에, 장소는 드라이 아이스에이 ML 사이즈 microfuge 튜브를 분류. 조사는 안락사의 방법을 선택합니다. 우리는 isoflurane, 이상적으로, 기화기를 사용하여야있는 매우 간단한 마취를하고 재현성 결과가 있습니다. 다만, 사용할 …

Discussion

그림 1에 명시된 바와 같이 위에 설명된 방법은 도파민의 여러 설치 했어요 그리고 쥐 드나 마우스 중 하나에서 얻은 SN 또는 VTA 중 하나를 샘플로부터 조절 단백질의 TH, DAT, 그리고 VMAT2를 얻을 수 있습니다. 다시 말하지만,이 프로토콜을 수행의 장점은 조사가 도파민은 거의 모든 실험적인 패러다임 하에서 생체내에서 규제하고, 그동안, 어떤에서 필요한 동물의 수를 줄임으로써 상당한 실?…

Materials

HPLC system:

The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system.

The column is maintained at 30-45°C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run.

The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data.

Pump: Shimadzu LC-10AD
Cell: BAS Cross Flow. Glassy carbon working electrode at 0.780 and 0.950 V potential.
Detector: BAS LC-4B operated in dual channel mode.
Data Acq. System: Waters Empower Pro 2.
Injector: Waters WISP 717
Column: Waters Spherosorb ODS-1, 5 μM particle, 4.4 mm X 250 mm.

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	– J.T. Baker	4095-02
Trizma Base	Sigma	T1503-1KG
Trizma HCl	Sigma	T3253-1KG
Glycerol	Sigma	G8773-500 mL
PVP-40	Sigma	PVP40-1KG
dPBS	Gibco	21600-069
Tween20	Sigma	P1379-500 mL
Glycine	Sigma	G8898-1KG
Ponceau S	Fluka	81460
Bromophenol Blue	Sigma	B8026-5G
Dithiothreitol	Sigma	D-9163
Protein Standard 2 mg BSA	Sigma	P5619-25VL
Pierce BCA Protein Assay Reagent A	Thermo- Fisher Scientific	23223
Precision Plus Protein Standard	Bio Rad	161-0373
[125I]-protein A, specific activity	Perkin-Elmer

Table 2. Specific reagents.

Reagents	Formulas
10% SDS	10 g SDS, 100 mL DI H20
1% SDS (pH to 8.2)	10 mL 10%SDS 60.5 mg Trizma Base 37.22 mg EDTA 90 mL DI H20
Copper II Sulfate Solution	1 g Copper II sulfate 25 mL DI H20
3X Sample Buffer	Trizma Base 2.27 g SDS 6 g Dithiothreitol 0.463 g Glycerol 30 g Bromophenol Blue 10 mg D I H20 (initially add above reagents to 40 mL of H20 in a graduated cylinder; then add H20 until volume reaches 100 mL) HCl (add as needed to reach pH of 6.85) Freeze solution in 50 2.0 mL tubes. (makes 100 mL): Volume of 3X Sample Buffer needed = ½ volume of SDS used in sample.
1X Sample Buffer	Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20
10X Running Buffer (Makes 4 L)	Trizma Base 121.1 g Glycine 577 g SDS 40 g
10X Transfer Buffer: (Makes 4 L)	Glycine 360 g Trizma Base 96 g
Ponceau	Ponceau S. 0.5 g Acetic Acid 5 mL DI H20 95 mL
.2% HCl Solution	5.2 mL HCl in 500mL of DI H20
PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L)	PVP-40 40 g dPBS 38.2 g Tween20 2 g Thimerisol 0.4 g 1M Tris pH 7.6 (60.6 g Tris HCl + 13.9 g Tris Base in 500 mL DI H20)- 50 mL
10X Blot Buffer (Makes 4 L)	Tween 20 20 g Tris Base 14 g Tris HCl 61 g

Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas.

Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock ¹¹.