Insect hemocyten voeren tal van belangrijke functies, zowel immune als niet-immune, in alle stadia van insecten ontwikkeling. Onze huidige kennis van hemocyte soorten en functie komt van studies over insecten genetische modellen. Hier presenteren we een methode voor het extraheren, het kwantificeren en visualiseren hemocyten van wilde rupsen.
Insect hemocyten (gelijk aan zoogdieren witte bloedcellen) spelen een belangrijke rol in diverse fysiologische processen in het leven van een insect cyclus 1. In larvale stadia van insecten behorend tot de orde van de Lepidoptera (motten en vlinders) en Diptera (ware vliegen), worden hemocyten gevormd uit de lymfeklier (een gespecialiseerde hematopoietische orgel) of embryonale cellen en kan worden uitgevoerd door middel van het volwassen stadium. Embryonale hemocyten zijn betrokken bij celmigratie gedurende de ontwikkeling en chemotaxis regelgeving tijdens de ontsteking. Zij nemen ook deel in cel apoptose en zijn essentieel voor embryogenese 2. Hemocyten bemiddelen de cellulaire arm van het insect aangeboren immuunrespons die verschillende functies, zoals celspreiding, cel aggregatie, vorming van nodules, fagocytose en inkapseling van indringers 3 omvat. Zij zijn ook verantwoordelijk voor het orkestreren specifieke humorale afweer insect tijdens infectie, zoals de productie van antimicrobiële peptiden en andere effectormoleculen 4, 5. Hemocyte morfologie en functie zijn voornamelijk bestudeerd in genetische of fysiologische insect modellen, zoals de fruitvlieg Drosophila melanogaster 6, 7, de muggen Aedes aegypti en Anopheles gambiae 8, 9 en de tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. Er is echter weinig informatie bestaat momenteel over de diversiteit, classificatie, morfologie en functie van hemocyten in niet-model insectensoorten, met name die uit het wild gehaald 12.
Hier beschrijven we een eenvoudig en efficiënt protocol voor de extractie van hemocyten van wilde rupsen. We gebruiken voorlaatste instar Lithacodes Fasciola (geel-schouders slug mot) (figuur 1) en Euclea delphinii (spiny eiken slug) rupsen (Lepidoptera: Limacodidae) en laten zien dat er voldoende hoeveelheden hemolymfe (insect bloed)kan worden geïsoleerd en hemocyte aantal getelde van individuele larven. Deze methode kan worden gebruikt om efficiënt onderzoeken hemocyte types in deze soorten en in andere lepidoptera rupsen geoogst van het veld, of het kan eenvoudig worden gecombineerd met immunologische assays ontworpen hemocyte functie onderzoeken na infectie met bacteriën of parasitaire organismen 13.
Werkwijzen voor het extraheren van hemocyten medisch belangrijke lepidoptera insecten en insecten model eerder gemeld 9, 14. Hemocyte extractie zijn aangepast op basis van de insectensoorten, de ontwikkelingsfase van het insect en de morfologische kenmerken. Zo kan hemolymfe isolatie van Manduca larven gemakkelijk worden uitgevoerd door knippen de gebogen hoorn het einde van de buik 15. Omdat slug rupsen (Limacodidae) missen deze buik structuur, hebben we een aparte protocol voor hemolymfe…
The authors have nothing to disclose.
TMS werd gesteund door de Harlan Trust Fellowship (GWU) tijdens deze studie. Financiering voor veld verzamelen en kweken van L. Fasciola en E. delphinii werd verstrekt door NSF subsidie DEB 0642438 naar JTL.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
Borosilicate glass tubes | Sutter Instruments | B100-50-10 | OD: 1.0, ID: 0.50 mm |
Grace’s Medium | Sigma | G8142 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH3007102 | Heat inactivated |
Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11252-40 | |
Neubauer hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
Plastic tubing | Tri-Tech | TT-3-32OD | OD: 3/32”, ID: 1/32′ |
Glass medical syringe | Fortuna Optima | D-97877 | 50 ml volume |
Blunt end needle | Small Parts | NE-162PL-25 | 16 Gauge x 1″ length |