वन्य कैटरपिलर से Hemocytes निकालने के लिए एक साधारण प्रोटोकॉल
Summary
कीट hemocytes कई महत्वपूर्ण कार्य, कीट विकास के सभी चरणों के दौरान दोनों प्रतिरक्षा और गैर प्रतिरक्षा, ले. हमारे hemocyte प्रकार और समारोह के वर्तमान ज्ञान कीट आनुवंशिक मॉडल पर अध्ययन से आता है. यहाँ, हम निकालने, बढ़ाता और जंगली कैटरपिलर से hemocytes visualizing के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं.
Abstract
कीट hemocytes (स्तनधारी सफेद रक्त कोशिकाओं के बराबर) एक कीट के जीवन चक्र के दौरान 1 कई शारीरिक प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. Lepidoptera (पतिंगे और तितलियों) और Diptera (सच मक्खियों) के आदेश से संबंधित कीड़ों के लार्वा चरणों में, hemocytes लसीका ग्रंथि (एक विशेष hematopoietic अंग) या भ्रूण कोशिकाओं से गठन कर रहे हैं और वयस्क मंच के माध्यम से किया जा सकता है. भ्रूण hemocytes सेल प्रवास में सूजन के दौरान विकास और chemotaxis विनियमन के दौरान शामिल हैं. उन्होंने यह भी सेल apoptosis में भाग लेने के लिए और 2 embryogenesis के लिए आवश्यक हैं. Hemocytes कीट सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के सेलुलर हाथ है कि सेल प्रसार, सेल एकत्रीकरण, पिंड का गठन, phagocytosis और विदेशी 3 आक्रमणकारियों के encapsulation के रूप में कई कार्यों, शामिल मध्यस्थता. उन्होंने यह भी जनसंपर्क के रूप में इस तरह के संक्रमण के दौरान विशिष्ट कीट humoral गढ़ orchestrating के लिए जिम्मेदार है,रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स और अन्य effector 4 अणुओं, 5 की oduction. Hemocyte आकारिकी और समारोह मुख्य रूप से आनुवंशिक या शारीरिक कीट मॉडल में अध्ययन किया गया है, फल मक्खी, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर 6, 7, मच्छरों एडीज aegypti और एनोफ़ेलीज़ gambiae 8, 9 और तम्बाकू hornworm, Manduca Sexta 10, 11 सहित. हालांकि, थोड़ी जानकारी वर्तमान में विविधता, वर्गीकरण, आकृति विज्ञान और गैर मॉडल कीट प्रजातियों, विशेष रूप से उन जंगली 12 से एकत्र hemocytes के समारोह के बारे में मौजूद है.
यहाँ हम जंगली कैटरपिलर से hemocytes निकालने के लिए एक सरल और कुशल प्रोटोकॉल का वर्णन. हम अंत से पहले instar Lithacodes fasciola (पीले कंधों काउंटर कीट) (1 चित्रा) और (काँटेदार ओक काउंटर) Euclea delphinii कैटरपिलर (Lepidoptera: Limacodidae) का उपयोग करते हैं और पता चलता है कि hemolymph (कीट रक्त की पर्याप्त मात्रा में)अलग किया जा सकता है और व्यक्तिगत लार्वा से hemocyte संख्या गिना. कुशलतापूर्वक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य संबंधित lepidopteran क्षेत्र से काटा कैटरपिलर में इन प्रजातियों में hemocyte प्रकार का अध्ययन करने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया जा सकता है, या यह प्रतिरक्षाविज्ञानी माइक्रोबियल या परजीवी 13 जीवों के साथ संक्रमण के बाद hemocyte समारोह की जांच के लिए बनाया गया assays के साथ आसानी से जोड़ा जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
चिकित्सकीय महत्वपूर्ण कीड़े और lepidopteran मॉडल कीड़े से hemocytes निकालने के लिए तरीके पहले 9, 14 बताया गया है. Hemocyte निष्कर्षण तरीकों कीट प्रजातियों के अनुसार अनुकूलित कर रहे हैं, कीट और उसके morphological विशेषताओं के वि?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
टीएमएस Harlan ट्रस्ट फैलोशिप (GWU) द्वारा इस अध्ययन के दौरान समर्थित किया गया. क्षेत्र के संग्रह के लिए अनुदान और एल प्रजनन fasciola और ई. delphinii JTL NSF अनुदान 0642438 देब द्वारा प्रदान किया गया.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Borosilicate glass tubes | Sutter Instruments | B100-50-10 | OD: 1.0, ID: 0.50 mm |
| Grace’s Medium | Sigma | G8142 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH3007102 | Heat inactivated |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11252-40 | |
| Neubauer hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| Plastic tubing | Tri-Tech | TT-3-32OD | OD: 3/32”, ID: 1/32′ |
| Glass medical syringe | Fortuna Optima | D-97877 | 50 ml volume |
| Blunt end needle | Small Parts | NE-162PL-25 | 16 Gauge x 1″ length |
References
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 677 (2006).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (7), 542 (2007).
- Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15 (1), 1 (2008).
- Fauvarque, M. O., Williams, M. J. Drosophila cellular immunity: a story of migration and adhesion. J. Cell Sci. 124 (9), 1373 (2011).
- Nehme, N. T., Quintin, J., Cho, J. H., Lee, J., Lafarge, M. C., Kocks, C., Ferrandon, D. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).
- Ulvila, J., Vanha-Aho, L. M., Rämet, M. Drosophila phagocytosis – still many unknowns under the surface. APMIS. 119 (10), 651 (2011).
- Moreira, C. G., Regan, J. C., Zaidman-Remy, A., Jacinto, A., Praq, S. Drosophila hemocyte migration: an in vivo assay for directional cell migration. Methods Mol. Biol. 769, 249 (2011).
- Hillyer, J. F. Mosquito immunity. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 218 (2010).
- Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36 (12), 891 (2006).
- Jiang, H., Vilcinskas, A., Kanost, M. R. Immunity in lepidopteran insects. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 181 (2010).
- Eleftherianos, I., Xu, M., Yadi, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Plasmatocyte-spreading peptide (PSP) plays a central role in insect cellular immune defenses against bacterial infection. J. Exp. Biol. 212 (12), 1840 (2009).
- Ribeiro, C., Brehélin, M. Insect haemocytes: what type of cell is that. J. Insect Physiol. 52 (5), 417 (2006).
- Beetz, S., Brinkmann, M., Trenczek, T. Differences between larval and pupal hemocytes of the tobacco hornworm, Manduca sexta, determined by monoclonal antibodies and density centrifugation. J. Insect Physiol. 50 (9), 805 (2004).
- Beetz, S., Holthusen, T. K., Koolman, J., Trenczek, T. Correlation of hemocyte counts with different developmental parameters during the last larval instar of the tobacco hornworm, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 67 (2), 63 (2008).
- Eleftherianos, I., Joyce, S., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695 (2010).
- Qayum, A. A., Telang, A. A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (51), e2772 (2011).
