Un protocole simple pour extraire l'hémocytes de chenilles sauvages

Résumé

Hémocytes d'insectes effectuer de nombreuses fonctions importantes, tant immunitaires et non immunitaires, à tous les stades de développement des insectes. Notre connaissance actuelle des types hémocytaires et de la fonction provient d'études sur les insectes des modèles génétiques. Ici, nous présentons une méthode pour l'extraction, la quantification et la visualisation des hémocytes des chenilles sauvages.

Résumé

Hémocytes d'insectes (l'équivalent de mammifères globules blancs) jouent un rôle important dans plusieurs processus physiologiques tout au long du cycle de vie d'un insecte ^1. Dans les stades larvaires des insectes appartenant aux ordres des lépidoptères (papillons) et des diptères (mouches vraies), les hémocytes sont formés à partir de la glande lymphatique (un organe spécialisé hématopoïétique) ou des cellules embryonnaires et peuvent être transportés jusqu'au stade adulte. Hémocytes embryonnaires sont impliqués dans la migration cellulaire au cours de règlement sur le développement et la chimiotaxie cours de l'inflammation. Ils participent également à l'apoptose des cellules et sont essentiels pour l'embryogenèse ^2. Hémocytes arbitrer le bras cellulaire de la réponse immunitaire innée des insectes qui comprend plusieurs fonctions, telles que l'agrégation cellulaire cellule propagation,, formation de nodules, la phagocytose et l'encapsulation des envahisseurs étrangers ^3. Ils sont également responsables de l'orchestration spécifiques insectes défenses humorales cours de l'infection, comme le production de peptides antimicrobiens et d'autres molécules effectrices ^{4, 5.} La morphologie et la fonction hémocytes ont été principalement étudiés dans génétiques ou physiologiques modèles d'insectes, y compris la drosophile, Drosophila melanogaster ^{6, 7,} les moustiques Aedes aegypti et Anopheles gambiae ^{8, 9} et le sphinx du tabac, Manduca sexta ^{10, 11.} Cependant, peu d'informations existent actuellement sur ​​la diversité, la classification, la morphologie et la fonction des hémocytes en espèces d'insectes non du modèle, en particulier celles recueillies auprès de ¹² sauvage.

Nous décrivons ici un protocole simple et efficace pour extraire les hémocytes des chenilles sauvages. Nous utilisons l'avant-dernier stade Lithacodes fasciola (papillon jaune lingot d'épaules) (figure 1) et Euclea delphinii (aiguillat chêne limace) chenilles (Lepidoptera: Limacodidae) et montrent que des volumes suffisants de l'hémolymphe (sang des insectes)On peut isoler et nombres comptés à partir de larves hémocytaires individu. Cette méthode peut être utilisée pour étudier efficacement types hémocytaires chez ces espèces, ainsi que dans d'autres chenilles de lépidoptères liées récoltées sur le terrain, ou il peut être facilement combiné avec des dosages immunologiques conçus pour étudier la fonction des hémocytes suite à une infection microbienne ou avec des organismes parasitaires ^13.

Protocole

1. Préparation des matériaux

1. Préparer aiguilles (1-2 um et pointe conique 3-4 mm) en utilisant des tubes capillaires en verre de borosilicate et un extracteur micropipette. Réglages de l'appareil: rampe: 561; vitesse: 20; chaleur: 560; retard: 1; traction: 100; pression: 500.
2. Préparer la solution de collecte: 60% de milieu de Grace (GM) supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et 20% de tampon anticoagulant (98 mM NaOH, 186 mM de NaCl, 1,7 mM EDTA et 41 mM d'acide citrique, pH 4,5 ). La solution ci-dessus est préparée dans des conditions stériles frais et conservés dans la glace en tout temps.
3. Préparer la solution tampon ....

Résultats

Le protocole décrit ici permet la collecte d'un volume minimum de 10-20 ul d'hémolymphe d'insecte des chenilles individuelles. Hémocytes recueillies à l'aide de cette méthode sont libres d'agglutination cellulaire, défauts mélanisation, débris de tissus ou d'autres contaminants. Par conséquent hémocytes peuvent être facilement observés et comptés sous le microscope, et plusieurs insectes peuvent être observés dans un Hosur quelques-uns. Nous avons observé que la majorité des hémocytes dans nos éc.......

Discussion

Méthodes d'extraction hémocytes d'insectes d'importance médicale et les insectes lépidoptères modèle ont déjà été signalés ^{9, 14.} Méthodes d'extraction hémocytaires sont adaptées en fonction des espèces d'insectes, le stade de développement de l'insecte et de ses caractéristiques morphologiques. Par exemple, l'isolement hémolymphe de larves de Manduca peut être facilement réalisée en coupant la corne recourbée près de l'extrémité de l'abdomen ^15. Parce q.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Micropipette extracteur	Sutter Instruments	P-1000
Tubes en verre borosilicaté	Sutter Instruments	B100-50-10	OD: 1,0, ID: 0,50 mm
Grâce à moyen	Sigma	G8142
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	SH3007102	Inactivé par la chaleur
Dumont # 5 forceps	Outils des sciences Beaux-	11252-40
Neubauer hémocytomètre	Hausser scientifique	3200
Plastique tubing	Tri-Tech	TT-3-32OD	OD: 3/32'', ID: 1/32 "
Verre médical seringue	Fortuna Optima	D-97877	Un volume de 50 ml
Aiguille extrémité émoussée	Petites pièces	NE-162PL-25	Calibre 16 x 1 "Longueur