Um protocolo simples para extrair Hemócitos de Lagartas selvagens
Summary
Hemócitos de insetos realizar muitas funções importantes, tanto imunes e não-imunes, em todas as fases do desenvolvimento do inseto. Nosso conhecimento atual de tipos de hemócitos e função vem de estudos sobre insetos modelos genéticos. Aqui, apresentamos um método para extrair, quantificar e visualizar hemócitos de lagartas selvagens.
Abstract
Hemócitos de insetos (equivalente a mamíferos células brancas do sangue) têm um papel importante em vários processos fisiológicos ao longo do ciclo de vida de um inseto 1. Em estágios larvais de insectos pertencentes à ordem dos lepidópteros (borboletas e traças) e Diptera (moscas verdadeiras), são formados a partir de hemócitos do gânglio linfático (um órgão especializado hematopoiética) ou células embrionárias e pode ser carregado até à fase adulta. Hemócitos embrionários estão envolvidos na migração de células durante o desenvolvimento e a quimiotaxia de regulação durante a inflamação. Eles também participam de apoptose das células e são essenciais para a embriogênese 2. Hemócitos mediar o braço celular da resposta imune inata de insectos, que inclui várias funções, tais como a agregação de células de células difusão, formação de nódulos, e a fagocitose de encapsulamento de invasores estranhos 3. Eles também são responsáveis por orquestrar específicas de insectos defesas humorais durante a infecção, tais como a produção de péptidos antimicrobianos e outras moléculas efectoras 4, 5. Hemócitos morfologia e função têm sido principalmente estudados em modelos genéticos ou fisiológica de insectos, incluindo a mosca da fruta, Drosophila melanogaster 6, 7, os mosquitos Aedes aegypti e Anopheles gambiae 8, 9 e o hornworm tabaco, Manduca sexta 10, 11. No entanto, pouca informação existe atualmente sobre a diversidade, classificação, morfologia e função de hemócitos em espécies não-modelo de insetos, especialmente aqueles coletados de 12 a selvagem.
Aqui nós descrevemos um protocolo simples e eficiente para extrair hemócitos de lagartas selvagens. Usamos penúltimo estádio Lithacodes fasciola (amarelo Traça lesma) (Figura 1) e Euclea delphinii (spiny lesma carvalho) lagartas (Lepidoptera: Limacodidae) e mostram que os volumes suficientes de hemolinfa (sangue do inseto)pode ser isolado e os números contados a partir de hemócitos larvas individual. Este método pode ser utilizado de forma eficiente para estudar tipos de hemócitos nestas espécies, bem como em outras lagartas relacionados colhidas a partir do campo, ou pode ser facilmente combinado com ensaios imunológicos concebidos para investigar a função hemocitária após infecção com micróbios ou parasitas 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Métodos para a extração de hemócitos de insetos de importância médica e insetos lepidópteros modelo foram relatados 9, 14. Métodos de extração de hemócitos são adaptados de acordo com as espécies de insetos, o estágio de desenvolvimento do inseto e suas características morfológicas. Por exemplo, o isolamento a partir da hemolinfa de larvas Manduca pode ser prontamente realizada cortando o chifre curvo perto do fim do abdómen 15. Porque lagartas Slug (Limacodidae) não poss…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TMS foi apoiado pela confiança Harlan Fellowship (UGT) durante este estudo. O financiamento para a coleta de campo e criando L. fasciola e E. delphinii foi fornecido pela concessão do NSF DEB 0642438 para JTL.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Borosilicate glass tubes | Sutter Instruments | B100-50-10 | OD: 1.0, ID: 0.50 mm |
| Grace’s Medium | Sigma | G8142 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH3007102 | Heat inactivated |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11252-40 | |
| Neubauer hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| Plastic tubing | Tri-Tech | TT-3-32OD | OD: 3/32”, ID: 1/32′ |
| Glass medical syringe | Fortuna Optima | D-97877 | 50 ml volume |
| Blunt end needle | Small Parts | NE-162PL-25 | 16 Gauge x 1″ length |
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