Простой протокол для извлечения Гемоциты от диких гусениц
Summary
Насекомое гемоцитов выполнять многие важные функции, как иммунные и не иммунные, на всех этапах развития насекомых. Наши нынешние знания гемоцитов типов и функции в исследованиях на насекомых генетических моделей. Здесь мы представляем метод для извлечения, количественной оценки и визуализации гемоцитов от диких гусениц.
Abstract
Насекомое гемоцитов (эквивалент млекопитающих белых клеток крови) играет важную роль в ряде физиологических процессов протяжении всего жизненного цикла насекомого 1. В личиночной стадии насекомых, принадлежащих к приказу чешуекрылых (бабочек) и двукрылых (истинные мухи), гемоцитов формируются из лимфатических желез (специализированных кроветворных органов) или эмбриональных клеток и может быть доведена до взрослой стадии. Эмбриональные гемоцитов участвуют в миграции клеток в процессе развития и хемотаксис регулирования при воспалении. Они также принимают участие в апоптоз клеток и необходимы для эмбриогенеза 2. Гемоциты посредником сотовой руку насекомых врожденного иммунного ответа, который включает в себя несколько функций, таких как сотовые распространения, агрегация клеток, образование узелков, фагоцитозу и инкапсуляции иноземных захватчиков 3. Они также несут ответственность за организацию конкретных насекомых гуморальной защиты во время инфекции, такие как PRoduction антимикробных пептидов и других эффекторных молекул 4, 5. Гемоцитов морфологии и функции в основном были изучены генетические или физиологические насекомых моделей, в том числе плодовой мухи, дрозофилы 6, 7, комары Aedes Aegypti и Anopheles gambiae 8, 9 и табачных hornworm, Manduca Sexta 10, 11. Тем не менее, мало информации, в настоящее время существует около разнообразие, классификация, морфология и функция гемоцитов в не-моделью видов насекомых, особенно те, собранных в дикой природе 12.
Здесь мы опишем простой и эффективный протокол для извлечения гемоцитов от диких гусениц. Мы используем предпоследнего возраста Lithacodes фасциола (желто-плечи пули моль) (рис. 1) и Euclea delphinii (колючий дуб пули) гусеницы (Lepidoptera: Limacodidae) и показать, что достаточных объемов гемолимфы (крови насекомых)могут быть выделены и гемоцитов номера отсчитывается от отдельных личинок. Этот метод может быть использован для эффективного изучения типов гемоцитов в этих видов, а также в других смежных гусениц чешуекрылых собрали с поля, или он может быть легко сочетается с иммунологических анализов предназначен для исследования гемоцитов функции после инфекции микроорганизмов или паразитов 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методы для извлечения гемоцитов из важных медицинских насекомых и чешуекрылых насекомых модель уже сообщалось ранее 9, 14. Гемоцитов методов добычи адаптированы в соответствии с видов насекомых, стадии развития насекомого и его морфологические особенности. Например, гемолимфы и?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TMS был поддержан Харлан целевых стипендий (УДВ) в ходе этого исследования. Финансирование коллекции полей и разведении L. фасциола и E. delphinii был предоставлен грант NSF DEB 0642438 на JTL.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Borosilicate glass tubes | Sutter Instruments | B100-50-10 | OD: 1.0, ID: 0.50 mm |
| Grace’s Medium | Sigma | G8142 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH3007102 | Heat inactivated |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11252-40 | |
| Neubauer hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| Plastic tubing | Tri-Tech | TT-3-32OD | OD: 3/32”, ID: 1/32′ |
| Glass medical syringe | Fortuna Optima | D-97877 | 50 ml volume |
| Blunt end needle | Small Parts | NE-162PL-25 | 16 Gauge x 1″ length |
References
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 677 (2006).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (7), 542 (2007).
- Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15 (1), 1 (2008).
- Fauvarque, M. O., Williams, M. J. Drosophila cellular immunity: a story of migration and adhesion. J. Cell Sci. 124 (9), 1373 (2011).
- Nehme, N. T., Quintin, J., Cho, J. H., Lee, J., Lafarge, M. C., Kocks, C., Ferrandon, D. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).
- Ulvila, J., Vanha-Aho, L. M., Rämet, M. Drosophila phagocytosis – still many unknowns under the surface. APMIS. 119 (10), 651 (2011).
- Moreira, C. G., Regan, J. C., Zaidman-Remy, A., Jacinto, A., Praq, S. Drosophila hemocyte migration: an in vivo assay for directional cell migration. Methods Mol. Biol. 769, 249 (2011).
- Hillyer, J. F. Mosquito immunity. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 218 (2010).
- Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36 (12), 891 (2006).
- Jiang, H., Vilcinskas, A., Kanost, M. R. Immunity in lepidopteran insects. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 181 (2010).
- Eleftherianos, I., Xu, M., Yadi, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Plasmatocyte-spreading peptide (PSP) plays a central role in insect cellular immune defenses against bacterial infection. J. Exp. Biol. 212 (12), 1840 (2009).
- Ribeiro, C., Brehélin, M. Insect haemocytes: what type of cell is that. J. Insect Physiol. 52 (5), 417 (2006).
- Beetz, S., Brinkmann, M., Trenczek, T. Differences between larval and pupal hemocytes of the tobacco hornworm, Manduca sexta, determined by monoclonal antibodies and density centrifugation. J. Insect Physiol. 50 (9), 805 (2004).
- Beetz, S., Holthusen, T. K., Koolman, J., Trenczek, T. Correlation of hemocyte counts with different developmental parameters during the last larval instar of the tobacco hornworm, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 67 (2), 63 (2008).
- Eleftherianos, I., Joyce, S., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695 (2010).
- Qayum, A. A., Telang, A. A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (51), e2772 (2011).
