荧光激活细胞分选（FACS）自主神经祖细胞的分离，从胎鼠的内脏器官的优化程序
Summary
一个优化的过程，净化神经嵴源性神经祖细胞从小鼠胚胎组织被描述。此方法采用荧光报告基因的表达，通过荧光激活细胞分选（FACS）分离的离散人口。该技术可以应用到隔离整个发展或从成人组织中的神经元亚群。
Abstract
在开发过程中，神经嵴（数控）的神经祖细胞迁移的神经管形成自主神经节，内脏器官，如小肠和下尿路。在开发过程中，这些细胞在成熟组织往往分散的整个组织，因此，使用激光捕获微解剖的方法离散人群的隔离是很难的。不过，他们可以直接可视化，如酪氨酸羟化酶（TH）神经元特异性基因的调控区域驱动的荧光记者表达。我们描述了产量高，可行的TH +神经祖细胞从胎鼠内脏组织，包括肠道和泌尿生殖道（LUT），基于分离和荧光激活细胞分选（FACS）进行了优化的方法。
TH基因编码的限速酶生产儿茶酚胺。肠道神经祖细胞开始表达TH期间ING在胎儿小肠1和TH他们迁移也是目前在成人骨盆神经节神经元2-4的一个子集。首次亮相的血统和这些神经元在其他方面的LUT，其隔离的分布尚未描述。神经祖细胞表达TH，可以很容易地可视化表达绿色荧光蛋白在小鼠携带的基因结构的Tg（TH-EGFP）DJ76Gsat/Mmnc 1。我们在小鼠胚胎成像这个基因的表达，以文件的发展中国家的LUT 15.5天后性交（DPC）的TH的分布+细胞，划定为0.5 DPC上午插件检测，并观察到的凝聚神经祖细胞的一个子集盆腔神经节表达EGFP的。
到隔离LUT的TH +神经元祖细胞，我们优化的方法，最初用来净化神经嵴干细胞从胎鼠小肠2-6。在此之前的努力隔离NC-派生的人口依靠鸡尾酒用胶原酶和胰蛋白酶消化获得细胞悬液，流式细胞仪。在我们的手中，这些方法产生的细胞悬液，从相对较低的可行性LUT。由于胎儿的LUT组织的神经祖细胞的发病率已经很低，我们成立了优化分离方法等，将增加在最终分解细胞生存。我们决心在Accumax温柔分离（创新的细胞技术公司），手动过滤，流量在低压力，使我们能够实现一贯更大的生存（细胞总数的70％），随后产量足够的神经祖细胞下游分析排序。我们所描述的方法，可以广泛应用于多种神经元的人口，无论从胎儿或成年小鼠组织隔离。
Protocol
Discussion
老鼠记者线条表达荧光记者正在成为广泛使用，通过多种努力在小鼠遗传学社区1,8,9。因此，说明这里的分离方法，可广泛应用于神经递质或受体的表达方式，无论从胎儿或成人组织为基础的离散神经元亚型隔离。虽然我们已经优化了基于荧光的转基因记者表达方法，它也可以被应用于标记活细胞免疫标记方法3-5,10表达细胞表面受体的样品。
在我们的手中，?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
笔者想感谢细胞分离方法和凯文·韦勒，大卫·弗莱厄蒂和布列塔尼马特洛克建议凯瑟琳·奥尔福德在范德比尔特大学医学中心和Melissa A.马瑟在流式细胞仪共享资源的支持与插图艺术的援助。我们感谢博士。杰克·毛思迪和肖恩·莫里森实施隔离的神经祖细胞的意见。 VMC流式细胞仪共享资源是由范德比尔特英格拉姆癌症中心（P29 CA68485）和范德比尔特消化系统疾病研究中心（P29 DK058404）的支持。这项工作是由来自美国国家卫生补助DK064251，DK086594，DK070219研究院的资金支持。
Materials
| Reagent Name | Vendor | Catalog number | Comments |
| Accumax | Sigma(mfr: Innovative Cell Technologies) | A7089-100ML | Store frozen in 1 ml aliquots |
| DNase I | Sigma | D-4527 | Stored frozen at -20 °C 5 mg/ml in 1xHBSS, (Used in Quench, Quench 1:5) |
| 10X PBS pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter |
| 10X HBSS w/o Ca or Mg | Gibco | 14185-052 | Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 21083027 | |
| Penicillin /Streptomycin 100X | Gibco | 15140-133 | Store aliquoted at -20 °C |
| BSA | Sigma | A3912-100G | Store aliquoted at -20 °C, 100 mg/ml in water |
| Biowhittaker 1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza | 17-737E | |
| 38 μm NITEX Nylon Mesh Membrane | Sefar America | 3-38/22 | Cut into ~3 cm squares. UV treat overnight to sterilize in the tissue culture hood. |
| 7-AAD | Invitrogen | A1310 | 1 mg/ml |
| TRIzol LS | Invitrogen | 10296-028 | |
| 5 ml polystyrene tubes | Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| Fine Dissecting Forceps | Fine Science Instruments | 11251-30 | Dumont#5 forcep, Dumoxel, standard tip 0.1×0.06mm |
| Dissecting Spoon | Fine Science Instruments | 10370-18 |
References
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