蛍光活性化細胞選別（FACS）胎児マウスの内臓からの自律神経前駆細胞の分離用に最適化された手順
Summary
胎児のマウス組織からの神経堤由来の神経前駆細胞を精製する最適化された手順が記載されています。このメソッドは、蛍光活性化セルソーティング（FACS）によって離散的集団を分離するために蛍光レポーター遺伝子からの発現を利用しています。技術が開発を通して、大人の組織から神経細胞集団を単離するために適用することができます。
Abstract
開発神経堤（NC）に由来神経前駆細胞は、腸と下部尿路のような内臓器官に自律神経節を形成する神経管から移行します。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションのようなメソッドを使用して、離散的集団のその分離は困難であるので、開発時には、成熟した組織の両方でこれらの細胞は、しばしば広く組織全体に分散されています。ただし、これらのチロシンヒドロキシラーゼ（TH）のようなニューロン特異的遺伝子の調節領域で駆動蛍光レポーターの発現によって直接可視化することができる。我々は可能なTHの高収率+腸解離と蛍光活性化セルソーティング（FACS）に基づいて、下の尿生殖路（LUT）を含む、胎児マウスの内臓組織から神経前駆細胞用に最適化する方法を説明します。
TH遺伝子は、カテコールアミンの生産のための律速酵素をコードしている。腸神経前駆細胞は、TH DURを表現し始める胎児の腸1とTHでの移行をることも大人の骨盤神経節ニューロンの2-4のサブセットに存在しています。この系統の最初の外観と、これらのLUTの他の側面のニューロン、およびその分離の分布が記載されていない。 THを発現する神経前駆細胞は、導入遺伝子コンストラクトのTg（TH-EGFP）DJ76Gsat/Mmnc 1を持つマウスにおけるEGFPの発現により容易に可視化することができる。我々は0.5 DPCとプラグ検出の朝を指定して、15.5日後に性交（DPC）で開発LUTにTHの分布+細胞を記録するために胎児のマウスでこの遺伝子の発現をイメージングし、観察された合体における神経前駆細胞のサブセット骨盤神経節急行EGFP。
LUT TH +神経前駆細胞を単離するために、我々は当初、胎児マウスの小腸2月6日から、神経堤幹細胞を精製するために使用された方法を最適化されています。依拠NC-から派生した集団を単離する前に努力フローサイトメトリー用細胞懸濁液を得るためのコラゲナーゼとトリプシンのカクテルで消化。私たちの手にこれらの方法は、比較的低い生存率LUTから細胞懸濁液を生成した。胎児のLUT組織における神経前駆細胞の既に低い発生率を考えると、我々は、最終的な解離の細胞生存率が増加されるような解離方法を最適化するために設定してください。我々は、私たちは下流の分析のために十分な神経前駆細胞のその後の収率で一貫してより大きな生存率（全細胞の> 70％）を達成することができ、低圧力での並べ替え、その穏やかなACCUMAXで解離（革新的なセルテクノロジーズ株式会社）、マニュアルフィルタリング、およびフローを決定した。我々が記述する方法が広く、胎児または成体マウス組織のいずれかからニューロン集団の様々な分離に適用することができます。
Protocol
Discussion
蛍光レポーターを発現するマウスレポーター線は、マウス遺伝学コミュニティ1,8,9の複数の努力を通じて、広く利用可能になっています。結果として、ここで示した解離法が広く、胎児または成体組織のいずれかから神経伝達物質や受容体の発現パターンに基づいて、離散的なニューロンのサブタイプの分離に適用することができます。我々は、蛍光遺伝子レポーターの発現に基づい…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、イラストで芸術支援のためヴァンダービルト大学医療センターとメリッサA. Musserでフローサイトメトリーの共有リソースでサポートするために細胞解離の方法とケビン·ウェラー、デビッド·フラハティとブルターニュマトロックの提案のためにキャサリン·アルフォードに感謝します。我々は、博士に感謝します。神経前駆細胞の分離を実装する上でのアドバイスジャックモッシャーとショーンモリソン。 VMCフローサイトメトリーの共有リソースは、ヴァンダービルト·イングラムがんセンター（P30 CA68485）とヴァンダービルト消化器病研究センター（P30 DK058404）によってサポートされています。この作品は、健康補助DK064251、DK086594、とDK070219の米国国立研究所からの資金によって支えられている。
Materials
| Reagent Name | Vendor | Catalog number | Comments |
| Accumax | Sigma(mfr: Innovative Cell Technologies) | A7089-100ML | Store frozen in 1 ml aliquots |
| DNase I | Sigma | D-4527 | Stored frozen at -20 °C 5 mg/ml in 1xHBSS, (Used in Quench, Quench 1:5) |
| 10X PBS pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter |
| 10X HBSS w/o Ca or Mg | Gibco | 14185-052 | Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 21083027 | |
| Penicillin /Streptomycin 100X | Gibco | 15140-133 | Store aliquoted at -20 °C |
| BSA | Sigma | A3912-100G | Store aliquoted at -20 °C, 100 mg/ml in water |
| Biowhittaker 1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza | 17-737E | |
| 38 μm NITEX Nylon Mesh Membrane | Sefar America | 3-38/22 | Cut into ~3 cm squares. UV treat overnight to sterilize in the tissue culture hood. |
| 7-AAD | Invitrogen | A1310 | 1 mg/ml |
| TRIzol LS | Invitrogen | 10296-028 | |
| 5 ml polystyrene tubes | Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| Fine Dissecting Forceps | Fine Science Instruments | 11251-30 | Dumont#5 forcep, Dumoxel, standard tip 0.1×0.06mm |
| Dissecting Spoon | Fine Science Instruments | 10370-18 |
References
- Gong, S. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
- Kruger, G. M. Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness. Neuron. 35, 657-669 (2002).
- Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity. Neuron. 35, 643-656 (2002).
- Walters, L. C., Cantrell, V. A., Weller, K. P., Mosher, J. T., Southard-Smith, E. M. Genetic background impacts developmental potential of enteric neural crest-derived progenitors in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease. Human Molecular Genetics. , (2010).
- Corpening, J. C. Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression. Genesis. 49, 599-618 (2011).
- Morrison, S. J. . Isolation of fetal rat neural crest stem cells (NCSC) from gut and sciatic nerve. , (2012).
- Skarnes, W. C. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474, 337-342 (2011).
- Harding, S. D. The GUDMAP database–an online resource for genitourinary research. Development. 138, 2845-2853 (2011).
- Joseph, N. M. Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut. J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).
- Newgreen, D. F., Murphy, M. Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration. Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).
