LabVIEW betjent Novel nanoliter Osmometer for Ice bindingsprotein Undersøgelser

Summary

Is proteiner (IBPs), også kendt som anti-fryseproteiner, inhiberer is vækst og er en lovende additiv til anvendelse ved kryopræservering af væv. Det vigtigste redskab til at undersøge IBPs er nanoliter osmometer. Vi udviklede et hjem designet køletrin monteret på et optisk mikroskop og styres ved hjælp af en specialbygget LabVIEW rutine. The nanoliter osmometer her beskrevne manipuleret prøvens temperatur i en ultra-følsom måde.

Abstract

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition proteins, are found in cold-adapted organisms and protect them from freeze injuries by interacting with ice crystals. IBPs are found in a variety of organism, including fish¹, plants^{2, 3}, arthropods^{4, 5}, fungi⁶, and bacteria⁷. IBPs adsorb to the surfaces of ice crystals and prevent water molecules from joining the ice lattice at the IBP adsorption location. Ice that grows on the crystal surface between the adsorbed IBPs develops a high curvature that lowers the temperature at which the ice crystals grow, a phenomenon referred to as the Gibbs-Thomson effect. This depression creates a gap (thermal hysteresis, TH) between the melting point and the nonequilibrium freezing point, within which ice growth is arrested^8-10, see Figure 1. One of the main tools used in IBP research is the nanoliter osmometer, which facilitates measurements of the TH activities of IBP solutions. Nanoliter osmometers, such as the Clifton instrument (Clifton Technical Physics, Hartford, NY,) and Otago instrument (Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand), were designed to measure the osmolarity of a solution by measuring the melting point depression of droplets with nanoliter volumes. These devices were used to measure the osmolarities of biological samples, such as tears¹¹, and were found to be useful in IBP research. Manual control over these nanoliter osmometers limited the experimental possibilities. Temperature rate changes could not be controlled reliably, the temperature range of the Clifton instrument was limited to 4,000 mOsmol (about -7.5 °C), and temperature recordings as a function of time were not an available option for these instruments.

We designed a custom-made computer-controlled nanoliter osmometer system using a LabVIEW platform (National Instruments). The cold stage, described previously^{9, 10}, contains a metal block through which water circulates, thereby functioning as a heat sink, see Figure 2. Attached to this block are thermoelectric coolers that may be driven using a commercial temperature controller that can be controlled via LabVIEW modules, see Figure 3. Further details are provided below. The major advantage of this system is its sensitive temperature control, see Figure 4. Automated temperature control permits the coordination of a fixed temperature ramp with a video microscopy output containing additional experimental details.

To study the time dependence of the TH activity, we tested a 58 kDa hyperactive IBP from the Antarctic bacterium Marinomonas primoryensis (MpIBP)¹². This protein was tagged with enhanced green fluorescence proteins (eGFP) in a construct developed by Peter Davies’ group (Queens University)¹⁰. We showed that the temperature change profile affected the TH activity. Excellent control over the temperature profile in these experiments significantly improved the TH measurements. The nanoliter osmometer additionally allowed us to test the recrystallization inhibition of IBPs^{5, 13}. In general, recrystallization is a phenomenon in which large crystals grow larger at the expense of small crystals. IBPs efficiently inhibit recrystallization, even at low concentrations^{14, 15}. We used our LabVIEW-controlled osmometer to quantitatively follow the recrystallization of ice and to enforce a constant ice fraction using simultaneous real-time video analysis of the images and temperature feedback from the sample chamber¹³. The real-time calculations offer additional control options during an experimental procedure. A stage for an inverted microscope was developed to accommodate temperature-controlled microfluidic devices, which will be described elsewhere¹⁶.

The Cold Stage System

The cold stage assembly (Figure 2) consists of a set of thermoelectric coolers that cool a copper plate. Heat is removed from the stage by flowing cold water through a closed compartment under the thermoelectric coolers. A 4 mm diameter hole in the middle of the copper plate serves as a viewing window. A 1 mm diameter in-plane hole was drilled to fit the thermistor. A custom-made copper disc (7 mm in diameter) with several holes (500 μm in diameter) was placed on the copper plate and aligned with the viewing window. Air was pumped at a flow rate of 35 ml/sec and dried using Drierite (W.A. Hammond). The dry air was used to ensure a dry environment at the cooling stage. The stage was connected via a 9 pin connection outlet to a temperature controller (Model 3040 or 3150, Newport Corporation, Irvine, California, US). The temperature controller was connected via a cable to a computer GPIB-PCI card (National instruments, Austin, Texas, USA).

Protocol

0. Indledende procedurer Glaskapillar til opløsning injektion. Ved hjælp af en kapillær aftrækker (Narishige, Tokyo, Japan), udarbejde en skarp pipette med en fin åbning fra en glaskapillar micro rør (Brand GMBH, Wertheim, Tyskland). Størrelsen af ​​åbningen bør verificeres ved at lede luft gennem kapillarrøret for at opnå fine bobler i rent vand. Hvis kapillarrøret er lukket, så kan man åbne den ved at bryde sin kant. Dette kan ske ved presning eller skrabe det let mod den vandholdige rørvæggene. Forberede den kapillære således at åbningen næsten er blokeret, men er tilstrækkelig åben til at tillade dannelsen af ​​sub-millimeter bobler. Kobber disc rengøring. Sonikeres de kobberskiverne i 10 minutter i 0,1% Micro-90 soap (Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois, USA), vask derefter med dobbeltdestilleret vand. Indføre diske i en isopropanol (teknisk) opløsning og sonikeres igen i 10 min. Finallieret, tørre diske med filtreret luft. Denne rengøring fase er afgørende for at undgå IBP forurening mellem forsøgene. Dobbelt-lag dækglas forsamling. En dækglas samling var parat til at give mulighed for prøve observation uden kondensering fugt på forsiden glasoverfladen. Dette blev opnået ved at placere et Drierite (WA Hammond Drierite, Xenia, Ohio, USA) partikel (2 mm i diameter) mellem to dækglas, der derefter blev limet med en varm lim pistol. Denne konfiguration forhindret kondensation, der kan blokere lyset, når prøven blev afkølet til lave temperaturer og fjernet behovet for at blæse tør luft på observationsvindue. 1. Køling Stage Set-up Slut vandstrømmen ind-og udløb af den afkølingstrinnet til 4 mm indvendig diameter Tygon-rør (Saint-Gobain, Paris, Frankrig), og tilslut vandstrømmen indgangsrøret til en vandpumpe. Tilslutte en 4 mm indre diameter Tygon rør til indløbet af afkølingstrinnet to levere tør luft. Luften blev tørret under anvendelse af en in-line Drierite-søjle. Betjen luft og vand pumper. Bemærk, at køleelementerne ikke bør køre uden et varmedræn. Tænd for temperatur controller, kamera, og LabVIEW rutine. 2. Prøvefremstilling Anbring en 3-4 pi dråbe immersionsolie B (Cargille laboratorier, Cedar Grove, New Jersey, USA) på bagsiden af ​​en 7 mm diameter kobber skive med 500 um huller boret gennem disken. Placer kobber disken i afkølingstrinnet med immersionsolie nedad. Tilslut kapillarrøret (den stumpe kant) til en 0,7 mm indre diameter Tygon rør forbundet ved den anden ende til en 2 ml glassprøjte (Poulten-Graf, Wertheim, Tyskland). Før anvendelse af kapillarrør, kontrollere den lille åbning af kapillaret for at sikre, at åbningen er passende størrelse (se de indledende procedurer). Sæt langsomt glass kapillær i den klargjorte IBP protein prøverøret (2,4 uM Mp IBP-GFP i 20 mM CaCl2 og 25 mM Tris-HCI ved pH 8, se reference 10 til fremstillingen detaljer) og træk glassprøjten indtil glaskapillar indeholder 0,1 gl af proteinopløsningen. Begynd videooptagelse via LabVIEW software. Sæt den skarpe kant af glaskapillar (indeholdende proteinopløsningen) ind i et af hullerne i kobber disk i afkølingstrinnet. Mens observere gennem mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan, 10x objektiv), omhyggeligt gennemtrænge immersionsolie lag med glaskapillar spids, og tryk på glas sprøjten (meget forsigtigt) at levere en lille mængde (~ 10 nl) af proteinet Opløsningen at skabe en 200 um dråber. Dæk hullet i afkølingstrinnet med det dobbelte lag dækglas igen (se de indledende procedurer). 3. TH Activity Måling Press køling knap og indstil temperaturen til -40 ° C. Indledningsvis vil opløsningen dråbe være klar. Ved lave temperaturer, typisk i området -30 ° C til -35 ° C, dråben skifter farve, hvilket indikerer, at løsningen er blevet frosset. Umiddelbart efter at prøven er frosset, øges temperaturen langsomt, indtil hovedparten isen begynder at smelte. En gradvis øgning af temperaturen er nødvendig for at undgå overskridelse af den temperatur, som kunne resultere i fuldstændig smeltning af prøven. Skifte til en 50x objektiv og begynder at smelte isen ved at justere temperaturen. Denne justering er interaktivt, og de sidste trin er typisk udført ved anvendelse af små temperaturforskelle trin på 0,002 ° C. Fortsætter med at smelte, indtil en enkelt krystal tilbage. Den endelige størrelse af krystal skal være omkring 10 um. Den højeste temperatur, ved hvilken smeltning er ophørt bestemmes til at være smeltepunktet og bestemmes nøjagtigt i den senere videoanalyse fase. <li> Indstil temperaturen til nogle få hundrededele af en grad Celsius under smeltepunktet af krystallen og begynde en temperaturstigning med en 10 min forsinkelse. Juster ramping sats som ønsket. I dette tidsrum, vil krystallen blive udsat for IBPs. Ved afslutningen af ​​10 min eksponeringstid, vil temperaturen falde automatisk under styring af LabVIEW rutine. Observere krystalform, efterhånden som temperaturen falder. På et tidspunkt kan den pludselige af iskrystal observeres. Temperaturen, ved hvilken dette sker er noteret som krystal burst temperatur. Brug video analyse for at bestemme den nøjagtige smeltepunkt og burst temperatur. Dels ved hjælp af video-analyse, finder den nøjagtige smeltepunkt. Minde om, at den højeste temperatur, ved hvilken smeltning er ophørt bestemmes til at være smeltepunktet. Dokumentere dette smeltepunktet i et regnearksprogram. Derefter bestemme præcis krystal burst temperatur, og dokumentere denne værdisamt. Forskellen mellem smeltepunktet og frysepunktet, eller krystal burst temperatur, er den termiske hysterese aktivitet IBP opløsningen. 4. Måling af Tidsafhængig TH Aktivitet Følge protokollen beskrevet i afsnit 3,1-3,3 til fremstilling af en enkeltkrystal af is. Efter dannelse af krystallen, indsætte forsinkelsestiden af ​​rampen som ønsket, og tænd rampen. Temperaturen vil falde med en fast rente (ifølge operatørernes krav) automatisk, når rampe forsinkelsestiden er passeret. Dokumentere den temperatur, ved hvilken krystallen burst sker. Beregn eksponeringen (den tid mellem krystal formation og krystal burst). Gentag forsøget for forskellige forsinkelsestider og plotte TH-aktivitet som funktion af eksponeringstiden at evaluere tidsafhængighed for TH-aktivitet.

Representative Results

Måling af TH tidsafhængighed The LabVIEW-betjent nanoliter osmometer letter udførelsen af ​​nøjagtige TH-aktivitet målinger. Den konstante temperatur nedsættelsessats tillod måling af TH tid afhængighed. Den nøjagtige temperaturstyring aktiveret af nanoliter osmometer var afgørende for disse eksperimenter. En eksponeringstid på en iskrystal til IBPs i opløsning er defineret som tidsperioden fra dannelsen af ​​krystallen (afslutningen af ​​smelteprocessen), indtil den pludselige vækst af is omkring krystallen (crystal burst). Vi fandt, at en eksponeringstid på de iskrystaller til IBPs afgørende påvirket TH-aktivitet. Korte perioder med IBP eksponering (nogle få sekunder) gav en lav TH-aktivitet i Mp IBP-GFP opløsning (2,4 uM) (figur 5). TH aktivitet steg med IBP eksponering, indtil det nåede et plateau ved 4 min IBP eksponering. Ved højere IBP koncentrationer pladenau blev opnået på kortere tid. Figur 1. Skematisk diagram IBPs adsorberet til is. Vedtaget med tilladelse fra 10. Figur 2. Den køletrin. A) Forbundet til rør på mikroskopet. B) uden de øverste bly. C) Skematisk diagram. Figur 3. Screenshot af LabVIEW interface. ClICK her for at se større figur. Figur 4. Temperaturstabilitet graf. Temperaturregulatoren blev indstillet til at sænke temperaturen 0,01 ° C hver 15 sek. Figur 5. Mp IBP TH-aktivitet som en funktion af iskrystal eksponeringstid til IBPs. Hvert tidspunkt er gennemsnittet af 3-6 eksperimenter.

Discussion

Dette arbejde demonstrerer driften af ​​en computer-styret nanoliter osmometer der muliggør nøjagtige målinger af TH aktivitet med ekstraordinær temperaturstyring. I enhver temperaturfølsom system skal uønskede temperaturgradienter undgås. For at undgå temperaturgradienter i apparatet præsenteres her, skal testopløsningen dråbe anbringes i midten af ​​et hul i kobber disc køletrin (trin 2.7). Desuden bør enkelt krystal være i midten af ​​dråben ikke i nærheden af ​​kanterne (i de fleste tilfælde vil dette ske spontant). Den tid beskrevne afhængighed angiver, at afkølingshastigheden kan påvirke TH aflæsninger. Således foreslår vi bl.a. en rapport af den tid, hvor krystallen var udsat for opløsningen forud for afkøling, og afkølingshastigheden. Vi typisk ventede 10 minutter før nedkørsel, temperaturen ved 0,01 ° C trin hver 4 sek.

De LabVIEW-kontrollerede cooling fase blev tilpasset til anvendelse med et omvendt mikroskop, som mikrofluidenheder kan termisk manipuleres. Dette system letter udførelsen af løsning udveksle forsøg med iskrystaller og IBPs markeret med eGFP ^{9, 10, 16.} LabVIEW-styret system, kan tilpasses til en Clifton trin ved at forbinde 3040 temperaturregulator via en udpeget tilpasning elektrisk kredsløb. Et sådant system drives i Davies lab ^17. Den LabVIEW software og den udpegede tilpasning elektrisk kredsløb design til Clifton scenen er tilgængelige efter anmodning.

Afslutningsvis beskriver vi en nanoliter osmometer der letter følsomme kontrol og manipulation af temperatur og hastigheden af ​​temperaturstigning og fald (med 0,002 ° C følsomhed), koordineret med en video-interface gennem en LabVIEW rutine for real-time analyse. Dette system kan udføre reproducerbare rate-kontrollerede forsøg, der er important for at undersøge kinetikken af ​​IBP interaktioner med is. Sådanne eksperimenter kan behandle flere lange omdiskuterede emner omkring virkningsmekanismen for IBPs.

Materials

Name	Company	Catalog Number/model	Comments
Immersion oil Type B	Cargille Laboratories	16484
Drierite	W.A. Hammond Drierite	043063 2270g
Micro 90 cleaning solution	Cole-Parmer	EW-18100-11
Capillary puller	Narishige	PB-7
Glass capillary tubes	Brand GNBH	7493 21	75 mm long, 1.15 diameter
Temperature controller	Newport, Irvine, California, United States	Model 3040	Model 3040
Light microscope	Olympus	Model BH2
10x objective	Olympus		S Plan 10, 0.3, 160/0.17
50x objective	Nikon		CF plan, 50X/0.55 EPI ELWD
CCD Camera	Provideo	CVC-140
Tygon tubes	Saint-Gobain, Paris, France		Tygon Formulation S-50-HL Tubing
Glass syringe (2 ml)	Poulten-Graf, Wertheim, Germany	7 10227
GPIB-PCI card	National instruments, Austin, Texas, USA	778032-01
Video frame grabber IMAQ-PCI-1407	National instruments, Austin, Texas, USA	322156B-01
LabVIEW System Design Software	National instruments, Austin, Texas, USA	Version 8
DiVx Author software	DiVx LLC, San Diego, CA, USA