LabVIEW fonctionnant Osmomètre nanolitre Novel des enquêtes de glace Binding Protein

Summary

Protéines de liaison de glace (IBP), également appelées protéines antigel, inhiber la croissance de la glace et sont un additif prometteur pour une utilisation dans la cryoconservation des tissus. Le principal outil utilisé pour étudier IBP est le osmomètre nanolitre. Nous avons développé une maison conçue étape de refroidissement monté sur un microscope optique et contrôlé à l'aide d'une routine sur mesure LabVIEW. L'osmomètre nanolitre décrit ici manipulé la température de l'échantillon d'une manière ultra-sensible.

Abstract

Les protéines de liaison à la glace (IBP), y compris les protéines antigel, les protéines structurantes de la glace, les protéines d’hystérésis thermique et les protéines d’inhibition de la recristallisation de la glace, se trouvent dans les organismes adaptés au froid et les protègent des blessures causées par le gel en interagissant avec les cristaux de glace. Les IBP se trouvent dans une variété d’organismes, y compris les poissons¹, les plantes^{2, 3}, les arthropodes^{4, 5}, les champignons⁶ et les bactéries⁷. Les IBP s’adsorbent à la surface des cristaux de glace et empêchent les molécules d’eau de rejoindre le réseau de glace au point d’adsorption de l’IBP. La glace qui se développe à la surface du cristal entre les IBP adsorbés développe une courbure élevée qui abaisse la température à laquelle les cristaux de glace se développent, un phénomène appelé effet Gibbs-Thomson. Cette dépression crée un espace (hystérésis thermique, TH) entre le point de fusion et le point de congélation hors équilibre, à l’intérieur duquel la croissance de la glace est arrêtée^8-10, voir Figure 1. L’un des principaux outils utilisés dans la recherche IBP est l’osmomètre de nanolitres, qui facilite les mesures des activités TH des solutions IBP. Les osmomètres de nanolitres, tels que l’instrument Clifton (Clifton Technical Physics, Hartford, NY,) et l’instrument Otago (Otago Osmometers, Dunedin, Nouvelle-Zélande), ont été conçus pour mesurer l’osmolarité d’une solution en mesurant la dépression du point de fusion des gouttelettes de volumes nanolitres. Ces appareils ont été utilisés pour mesurer les osmolarités d’échantillons biologiques, tels que les larmes¹¹, et se sont avérés utiles dans la recherche IBP. Le contrôle manuel de ces osmomètres de nanolitres a limité les possibilités expérimentales. Les changements de température ne pouvaient pas être contrôlés de manière fiable, la plage de température de l’instrument Clifton était limitée à 4 000 mOsmol (environ -7,5 °C) et les enregistrements de température en fonction du temps n’étaient pas une option disponible pour ces instruments.

Nous avons conçu un système d’osmomètre de nanolitres contrôlé par ordinateur sur mesure à l’aide d’une plate-forme LabVIEW (National Instruments). L’étage froid, décrit précédemment^{9, 10}, contient un bloc métallique à travers lequel l’eau circule, fonctionnant ainsi comme un dissipateur thermique, voir Figure 2. Des refroidisseurs thermoélectriques peuvent être pilotés à l’aide d’un contrôleur de température commercial qui peut être contrôlé via des modules LabVIEW, voir Figure 3. De plus amples détails sont fournis ci-dessous. Le principal avantage de ce système est son contrôle sensible de la température, voir Figure 4. Le contrôle automatisé de la température permet de coordonner une rampe de température fixe avec une sortie de microscopie vidéo contenant des détails expérimentaux supplémentaires.

Pour étudier la dépendance temporelle de l’activité TH, nous avons testé un IBP hyperactif de 58 kDa de la bactérie antarctique Marinomonas primoryensis (MpIBP)¹². Cette protéine a été marquée avec des protéines de fluorescence verte améliorée (eGFP) dans une construction développée par le groupe de Peter Davies (Queens University)¹⁰. Nous avons montré que le profil de changement de température affectait l’activité TH. L’excellent contrôle du profil de température dans ces expériences a considérablement amélioré les mesures de TH. L’osmomètre de nanolitre nous a également permis de tester l’inhibition de la recristallisation des IBP^{5, 13}. En général, la recristallisation est un phénomène dans lequel les gros cristaux grossissent au détriment des petits cristaux. Les IBP inhibent efficacement la recristallisation, même à de faibles concentrations^{14, 15}. Nous avons utilisé notre osmomètre contrôlé par LabVIEW pour suivre quantitativement la recristallisation de la glace et pour imposer une fraction de glace constante en utilisant simultanément l’analyse vidéo en temps réel des images et le retour de température de la chambre d’échantillonnage¹³. Les calculs en temps réel offrent des options de contrôle supplémentaires au cours d’une procédure expérimentale. Une platine pour un microscope inversé a été développée pour accueillir des dispositifs microfluidiques à température contrôlée, qui seront décrits ailleurs¹⁶.

Le système de l’étape froide

L’ensemble de l’étage froid (Figure 2) se compose d’un ensemble de refroidisseurs thermoélectriques qui refroidissent une plaque de cuivre. La chaleur est évacuée de la scène en faisant couler de l’eau froide à travers un compartiment fermé sous les refroidisseurs thermoélectriques. Un trou de 4 mm de diamètre au milieu de la plaque de cuivre sert de fenêtre d’observation. Un trou dans le plan de 1 mm de diamètre a été percé pour s’adapter à la thermistance. Un disque de cuivre sur mesure (7 mm de diamètre) avec plusieurs trous (500 μm de diamètre) a été placé sur la plaque de cuivre et aligné avec la fenêtre de visualisation. L’air a été pompé à un débit de 35 ml/sec et séché à l’aide de drierite (W.A. Hammond). L’air sec a été utilisé pour assurer un environnement sec au stade du refroidissement. La platine a été connectée via une prise de connexion à 9 broches à un régulateur de température (modèle 3040 ou 3150, Newport Corporation, Irvine, Californie, États-Unis). Le régulateur de température a été connecté via un câble à une carte GPIB-PCI d’ordinateur (National instruments, Austin, Texas, États-Unis).

Protocol

0. Procédures préliminaires

1. Capillaire en verre pour injection de solution. Aide d'un extracteur capillaire (Narishige, Tokyo, Japon), préparer une pipette marquée avec une ouverture bien à partir d'un tube de verre capillaire micro (Marque GMBH, Wertheim, Allemagne). La taille de l'ouverture doit être vérifiée par le passage d'air à travers le capillaire d'obtenir bulles fines à l'eau claire. Si le capillaire est fermé, alors on peut l'ouvrir en brisant son bord. Cela peut être accompli en appuyant sur ou de la rayer doucement contre l'eau contenant parois du tube. Préparer le capillaire telle que l'ouverture est pratiquement bloquée, mais est suffisamment ouvert pour permettre la formation de bulles sous-millimétriques.
2. Nettoyage disque de cuivre. Soniquer les disques de cuivre pendant 10 min dans 0,1% Micro-90 savon (Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois, USA), puis laver avec de l'eau bidistillée. Introduire les disques dans un mélange isopropanol solution (technique) et soniquer à nouveau pendant 10 min. Nageoireallié, sécher les disques à l'aide de l'air filtré. Cette étape de nettoyage est essentiel pour éviter la contamination IBP entre les expériences.
3. Assemblage lamelle double couche. Un assemblage lamelle a été préparé pour permettre une observation de l'échantillon, sans condensation de l'humidité sur la surface du verre de couverture. Ceci a été réalisé en plaçant un Drierite (WA Hammond Drierite, Xenia, Ohio, Etats-Unis) de particules (2 mm de diamètre) entre deux lamelles qui ont ensuite été collés avec un pistolet à colle chaude. Cette configuration empêche la condensation qui pourrait bloquer la vue lorsque l'échantillon a été refroidi à des températures basses et supprimé la nécessité de souffler de l'air sec sur la fenêtre d'observation.

1. Phase de refroidissement Set-up

1. Connectez l'entrée du flux de l'eau et de sortie de l'étape de refroidissement à 4 mm de diamètre intérieur des tubes Tygon (Saint-Gobain, Paris, France), et connecter le tube d'entrée du débit d'eau à une pompe à eau.
2. Connecter un tube intérieur 4 mm de diamètre Tygon à l'entrée de l'étage de refroidissement to fournir de l'air sec. L'air est séché en utilisant une colonne en ligne Drierite.
3. Actionner les pompes à air et de l'eau. Notez que les éléments de refroidissement ne doit pas être exécuté sans un dissipateur de chaleur.
4. Allumez le régulateur de température, appareil photo, et la routine LabVIEW.

2. Préparation des échantillons

1. Placez une goutte de 4.3 pi d'huile d'immersion B (Cargille laboratoires, Cedar Grove, New Jersey, Etats-Unis) sur la face arrière d'un disque de cuivre de diamètre 7 mm avec 500 trous forés pm à travers le disque.
2. Placez le disque de cuivre sur la scène de refroidissement avec le côté huile d'immersion vers le bas.
3. Raccorder le tube capillaire (le bord émoussé) pour un diamètre de 0,7 mm Tygon tube intérieur relié à l'autre extrémité sur une seringue 2 ml en verre (Poulten-Graf, Wertheim, Allemagne).
4. Avant d'utiliser le tube capillaire, vérifier la petite ouverture du capillaire de sorte que l'ouverture est d'une taille appropriée (voir les procédures préliminaires).
5. Insérez lentement la glaart capillaire dans le tube d'échantillon préparé IBP protéines (2,4 uM Mp IBP-GFP dans 20 _mM de CaCl2 et 25 mM de Tris-HCl à pH 8, voir la référence ¹⁰ pour les détails de préparation) et retirer la seringue en verre jusqu'à ce que le capillaire en verre contient 0,1 pl de la solution de protéine.
6. Commencez l'enregistrement vidéo via le logiciel LabVIEW.
7. Insérer la pointe dans le capillaire en verre (contenant la solution de protéine) dans l'un des trous dans le disque de cuivre sur l'étage de refroidissement.
8. Tout en observant au microscope (Olympus, Tokyo, Japon, objectif 10x), soigneusement pénétrer dans la couche d'huile d'immersion avec la pointe capillaire en verre, puis appuyez sur la seringue en verre (très délicatement) afin de fournir une petite quantité (environ 10 nl) de la protéine solution pour créer une gouttelette à 200 um.
9. Couvrez le trou dans la phase de refroidissement avec l'ensemble lamelle double couche (voir les procédures préliminaires).

3. Mesure de l'activité TH

1. Préss sur le bouton de refroidissement et régler la température à -40 ° C.
2. Initialement, la gouttelette solution doit être limpide. A basse température, typiquement dans la gamme -30 ° C à -35 ° C, la couleur des gouttelettes changements, ce qui indique que la solution a été congelé. Immédiatement après le prélèvement a gelé, augmenter la température lentement jusqu'à ce que la glace commence à fondre en vrac. Une augmentation progressive de la température est nécessaire pour éviter le dépassement de la température qui pourrait se traduire par la fusion complète de l'échantillon.
3. Basculer vers un objectif 50x et commencer à faire fondre la glace en réglant la température. Ce réglage est interactif, et les étapes finales sont généralement effectuées à l'aide des mesures de température petits de 0,002 ° C. Continuer à faire fondre jusqu'à ce qu'un monocristal reste. La taille finale du cristal doit être d'environ 10 um. La plus haute température à laquelle la fusion a cessé est déterminé comme étant le point de fusion est déterminé avec précision et dans l'étape d'analyse vidéo plus tard.
4. Régler la température à quelques centièmes de degré Celsius en dessous du point de fusion du cristal et de commencer une rampe de température avec un retard de 10 min. Ajuster le taux de rampe comme vous le souhaitez. Pendant ce temps, le cristal sera exposée aux IBP.
5. À la fin du temps de 10 min d'exposition, la température diminuera automatiquement sous le contrôle de la routine LabVIEW.
6. Observer la forme cristalline que la température diminue. À un certain moment, l'explosion soudaine du cristal de glace peuvent être observés. La température à laquelle cela se produit est à noter que la température éclat de cristal.
7. Utiliser l'analyse vidéo afin de déterminer le point de fusion et la température exacte d'éclatement. Tout d'abord, en utilisant l'analyse vidéo, trouver le point de fusion précis. Rappelons que la plus haute température à laquelle la fusion a cessé est déterminé comme étant le point de fusion. Documentez ce point de fusion dans un tableur. Ensuite, déterminer la température du cristal précise rafale, et documenter cette valeurainsi. La différence entre le point de fusion et le point de congélation, ou la température éclatement de cristal, est l'activité d'hystérésis thermique de la solution IBP.

4. Mesure de l'activité TH en fonction du temps

1. Suivre le protocole décrit dans les sections 3.1 à 3.3 pour préparer un monocristal de glace.
2. Après la formation de la glace, le temps de retard de la rampe comme vous le souhaitez, et tourner sur la rampe.
3. La température sera réduite à un taux fixe (en fonction des besoins des opérateurs) automatiquement une fois le temps de retard rampe est passée.
4. Documenter la température à laquelle se produit la rupture de cristal. Calculer le temps d'exposition (le temps entre la formation des cristaux et la salve de cristal).
5. Répéter l'expérience pour divers temps de retard et tracer l'activité TH en fonction de la durée d'exposition pour évaluer la dépendance temporelle de l'activité TH.

Results

Mesure de la dépendance temporelle TH

L'osmomètre nanolitre LabVIEW fonctionnant facilite l'exécution des mesures précises de l'activité TH. Le taux de réduction à température constante permet la mesure de la dépendance temporelle TH. Le contrôle précis de la température activée par l'osmomètre nanolitre était crucial pour ces expériences. Le temps d'exposition d'un cristal de glace à l'IBP en solution est définie comme étant la période de temps à partir de la formation de la glace (la fin du processus de fusion) jusqu'à ce que la croissance brusque de la glace autour du cristal (cristaux rafale). Nous avons constaté que le temps d'exposition des cristaux de glace à l'IBP cruciale affecté l'activité TH. De courtes périodes d'exposition IBP (quelques secondes) produit une activité TH bas dans le Mp IBP-GFP solution (2,4 uM) (Figure 5). L'activité TH augmente avec le temps d'exposition IBP jusqu'à ce qu'il atteigne un plateau à 4 min IBP exposition. À des concentrations plus élevées IBP, la plaqueau a été atteint à des temps plus courts.

IBP Figure 1. Schéma illustrant adsorbé sur de la glace. Adoptée avec la permission de ^10.

Figure 2. L'étape de refroidissement. A) reliés à des tubes sur le microscope. B) Sans plomb supérieure. Schéma C).

Figure 3. Capture d'écran de l'interface de LabVIEW. Click ici pour agrandir la figure.

Figure 4. Graphique Stabilité de la température. Le régulateur de température a été fixé pour abaisser la température de 0,01 ° C toutes les 15 secondes.

Figure 5. Activité Mp TH IBP en fonction du temps d'exposition pour les cristaux de glace IBP. Chaque point est la moyenne de temps de 3-6 expériences.

Discussion

Ce travail démontre le fonctionnement d'un osmomètre nanolitre commandé par ordinateur qui permet des mesures précises de l'activité TH avec contrôle de la température extraordinaire. Dans tout système sensible à la température, les gradients de température indésirables doivent être évitées. Afin d'éviter des gradients de température dans l'appareil présenté ici, la gouttelette de solution d'essai doit être positionné au centre d'un trou dans la phase de refroidissement en cuivre disque (étape 2,7). En outre, le cristal unique devrait être au centre de la goutte plutôt que près des bords (dans la plupart des cas, cela se produira spontanément). La dépendance temporelle décrite indique que la vitesse de refroidissement peuvent influencer les lectures TH. Ainsi, on propose notamment un rapport de la durée pendant laquelle le cristal a été exposée à la solution avant le refroidissement, ainsi que la vitesse de refroidissement. En général, nous a attendu 10 minutes avant de la décélération de la température de 0,01 ° C chaque étapes 4 sec.

Les co-contrôlées LabVIEWOling étape a été adapté pour être utilisé avec un microscope inversé sur lequel des dispositifs microfluidiques peuvent être manipulés thermiquement. Ce système facilite la réalisation d'expériences d'échange de solutions impliquant des cristaux de glace et IBPS taggés avec eGFP ^{9, 10, 16.} Le système à commande LabVIEW peut être adapté à un stade Clifton en connectant le contrôleur de température 3040 par l'intermédiaire d'un circuit électrique désigné adaptation. Un tel système est utilisé dans le laboratoire Davies ^17. Le logiciel LabVIEW et l'adaptation désigné conception de circuit électrique pour la phase de Clifton sont disponibles sur demande.

En conclusion, nous décrivons un osmomètre nanolitre qui facilite le contrôle et la manipulation sensible de la température et le taux d'augmentation de la température et une diminution (avec 0,002 ° C de sensibilité), en coordination avec une interface vidéo à travers une routine LabVIEW pour analyse en temps réel. Ce système peut effectuer reproductibles taux contrôlées par des expériences qui sont important pour enquêter sur la cinétique des interactions IBP avec de la glace. De telles expériences peuvent répondre à plusieurs questions débattues à long entourant le mécanisme d'action de IBP.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue / modèle	Commentaires
Huile à immersion de type B	Laboratoires Cargille	16484
Drierite	WA Hammond Drierite	043063 2270g
Micro solution de nettoyage 90	Cole-Parmer	EW-18100-11
Capillaire extracteur	Narishige	PB-7
Tubes capillaires en verre	Marque GNBH	7493 21	75 mm de long, 1,15 de diamètre
Températurecontrôleur	Newport, Irvine, Californie, États-Unis	Modèle 3040	Modèle 3040
Microscope optique	Olympe	Modèle BH2
Objectif 10x	Olympe		S Plan de 10, 0,3, 160/0.17
Objectif 50x	Nikon		CF plan, 50X/0.55 PEV ELWD
Caméra CCD	Provideo	CVC-140
Tubes Tygon	Saint-Gobain, Paris, France		Formulation Tygon S-50-HL tubes
Seringue en verre (2 ml)	Poulten-Graf, Wertheim, Allemagne	7 10227
GPIB-PCI	National Instruments, Austin, Texas, USA	778032-01
Vidéo cadre grabBER IMAQ PCI-1407-	National Instruments, Austin, Texas, USA	322156B-01
Logiciel LabVIEW System Design	National Instruments, Austin, Texas, USA	Version 8
Logiciel DivX Author	DiVx LLC, San Diego, CA, USA