الاصطناعية إنتاج حرير العنكبوت على نطاق المختبر
Summary
على الرغم من الخصائص المتميزة الميكانيكية والكيميائية الحيوية للعنكبوت الحرير، لا يمكن أن تحصد هذه المواد بكميات كبيرة بالوسائل التقليدية. نحن هنا وصف استراتيجية فعالة لزيادة ونقصان ألياف اصطناعية حرير العنكبوت، والتي هي عملية هامة بالنسبة للمحققين الذين يدرسون العنكبوت إنتاج الحرير واستخدامها على النحو الجيل المقبل من المواد الحيوية.
Abstract
كما تقدم المجتمع، وأصبحت أكثر ندرة الموارد، يصبح من المهم على نحو متزايد لزراعة التكنولوجيات الجديدة التي الحيوية مهندس الجيل القادم مع خصائص عالية الأداء. يجب تطوير مواد هذه الهيكلية الجديدة ستكون سريعة وفعالة من حيث التكلفة وتنطوي على منهجيات المعالجة والمنتجات التي هي صديقة للبيئة والتنمية المستدامة. العناكب تدور العديد من أنواع مختلفة من الألياف مع الخواص الميكانيكية المختلفة، وتقدم مصدرا غنيا للجيل المقبل المواد الهندسية لتقليد الطبيعة أن المنافس أفضل المواد الاصطناعية والطبيعية. منذ جمع كميات كبيرة من حرير العنكبوت الطبيعية أمر غير عملي، الاصطناعية إنتاج الحرير لديه القدرة على توفير العلماء من أجل الحصول على امدادات غير محدودة من المواضيع. ولذلك، إذا كانت عملية الغزل ويمكن أن تكون مبسطة والكمال، والألياف الاصطناعية العنكبوت لديهم إمكانية استخدام لمجموعة واسعة من التطبيقات التي تتراوح بين الدروع الواقية للبدن، خياطة جراحيةق والحبال والكابلات، والإطارات، وسلاسل للآلات الموسيقية، والمواد المركبة للطيران وتكنولوجيا الطيران. وضعنا من أجل المضي قدما في إنتاج حرير صناعي وعملية لانتاج الألياف التي تعرض التباين المنخفض في خصائص المواد الخاصة بهم من زيادة ونقصان لزيادة ونقصان، وبروتوكول الرطب الغزل يدمج التعبير عن بروتينات حرير العنكبوت المؤتلف في تنقية والبكتيريا وتركيز البروتينات ، تليها قذف الألياف ومعالجة ميكانيكية في مرحلة ما بعد زيادة ونقصان. وهذا هو أول تمثيل المرئية التي تكشف عن عملية خطوة بخطوة لزيادة ونقصان وتحليل ألياف الحرير الصناعي على نطاق المختبر. كما يوفر تفاصيل لتقليل اعتماد التباين بين ألياف نسج من مخدر الغزل نفسه. بشكل جماعي، وهذه الأساليب دفع عملية إنتاج الحرير الصناعي، مما أدى إلى ألياف عالية الجودة التي تفوق العنكبوت الحرير الطبيعي.
Introduction
حرير العنكبوت لديه الخصائص الميكانيكية غير العادية التي يقوم بها مواد من صنع الإنسان عدة، بما فيها عالية الشد الصلب، كيفلر والنايلون. 1 العناكب تدور على الأقل 6-7 أنواع الألياف المختلفة التي تعرض الخواص الميكانيكية المختلفة، تم تصميم كل منها مع كميات متفاوتة من الشد والتمدد لتنفيذ مهام محددة البيولوجية. العلماء البحث 2 يسعون بسرعة استخدام الحرير العنكبوت كما الحيوية الجيل القادم بسبب خصائصها الميكانيكية المعلقة، توافق مع الحياة الخاصة بهم، وطبيعتها غير السامة والمواد الخضراء. 3،4 بسبب أكل لحوم البشر و طبيعة السامة من العناكب، حصاد الحرير العنكبوت من خلال الزراعة ليست استراتيجية عملية لتلبية المطالب اللازمة للتصنيع على نطاق صناعي. لذلك، تحولت العلماء الى انتاج بروتينات الحرير المؤتلف في الكائنات المعدلة وراثيا في المختبر إلى جانب الغزل من ألياف تركيبية منحد ذاتها تنقية البروتينات. وكان 5-8 التعبير عن كامل مدة المؤتلف بروتينات حرير العنكبوت من الصعب من الناحية الفنية نظرا للخصائص الذاتية للتسلسل الجيني، والتي تشمل طبيعتها المتكررة جدا وأطوال المادية (> 15 كيلوبايت)، GC-غنية المحتوى ومنحاز ألانين وجليكاين كودون الاستخدام. 9-11 وحتى الآن، ركزت معظم المختبرات في التعبير عن أشكال اقتطاعها من البروتينات أمبولي الشكل الحرير الرئيسية MaSp1 أو MaSp2 باستخدام تسلسل [كدنا] جزئي أو الجينات الاصطناعية. 12-15 غزل الحرير الاصطناعي العنكبوت هي عملية صعبة تتطلب ولم يتم التمكن والمعرفة في عدة تخصصات علمية، وتعقيدات عملية الغزل وكشف تماما لعامة الناس عن طريق التمثيل الفيديو. في الواقع، سوى عدد قليل من المختبرات في جميع أنحاء العالم لديهم الخبرة للتعبير عن cDNAs حرير العنكبوت، تنقية بروتينات الحرير، وتدور الألياف الاصطناعية، وتأدية ما بعد تدور التعادل، ثم أخيرا اختبار خواصها مادة بيولوجية. 8،16،17 مناهج مختلفة للألياف تركيبية الغزل وشملت الغزل الرطب والجاف وكذلك أساليب electrospinning 16،18،19 جميع الإجراءات لديها هدف واحد مشترك – وضع بروتوكول الاصطناعية التي تنتج حرير العنكبوت مع الخواص الميكانيكية التي الطبيعية المواضيع منافس على نطاق واسع عمليات التصنيع التجاري.
نحن هنا وصف الإجراء لتوليد الحرير العنكبوت الاصطناعي على نطاق المختبر باستخدام منهجية الرطب الغزل. بالنسبة لأساليب الغزل وغيرها، وقد أنتجت الغزل الرطب أكثر النتائج متسقة لتحليل الألياف. نحن الخطوط العريضة بداية هذا الإجراء مع التعبير عن بروتينات الحرير المؤتلف في البكتيريا، تليها تنقية بهم، ومن ثم وصف الخطوات إعداد بروتين للغزل، بما في ذلك منهجية التعادل بعد تدور تطبق على الألياف "، كما نسج" يمكن أن ينتج عن المواضيع مع خصائص المواد التي تقترب من جودة الحرير العنكبوت الطبيعية. لدينا منهجيهتم تصميم Y لمحاكاة عن كثب عملية طبيعية غزل من ألياف الحرير، وأنه يعتمد بشدة على خبرتنا في الهندسة المعمارية وظيفة من وظائف الغدد المنتجة للحرير من محجر العين، وقطعة خبز نسيج العنكبوت. 20-22 وعلاوة على ذلك، فإننا نستنتج مع ما يلزم من خطوات لتحديد خصائص المواد من الألياف الاصطناعية باستخدام مقياس التوتر لرسم منحنيات الإجهاد والانفعال، والتي تسمح للمحققين لحساب قوة في نهاية المطاف، السلالة في نهاية المطاف، وصلابة من الألياف. وأخيرا، ولكن ذات قيمة كبيرة، لا يمكن للأجهزة الغزل، التخزين المؤقت، ورسم يكون في المنزل التي تم إنشاؤها باستخدام أجزاء المتاحة تجاريا، بدلا من شراء معدات مخصصة متقنة ومكلفة.
Protocol
Discussion
ألياف تركيبية من نسج هذه المنهجية هي ميكانيكيا على نفس الترتيب من حيث الحجم مقارنة مع الألياف الطبيعية. من خلال خفض كمية من خطأ بشري من قبل ميكنة التخزين المؤقت وعمليات السحب آخر زيادة ونقصان، والاختلاف بين العينات التجريبية هي أكثر رقابة وتقلص إلى حد كبير.
<p class="jov…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل جبهة الخلاص الوطني منح RUI MCB-0950372 و 1105310 DMR-بعنوان "التوصيف الجزيئي من الحرائر عنكبوت الأرملة السوداء، والسلوك الميكانيكي للالحرائر الغراء العنكبوت"، على التوالي.
Materials
| Reagent/Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| pBAD/TOPO ThioFusion Expression Kit | Invitrogen | K370-01 | |
| FastBreak Cell Lysis Reagent, 10x | Promega | V857C | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | Includes instructions for buffers |
| ProteoSilver Silver Stain Kit | Sigma-Aldrich | PROTSIL1-1KT | |
| FreeZone Lyophilizer | Labconco | 7960041 | FreeZone 12Plus |
| Hexafluoroisopropanol (HFIP) | Sigma-Aldrich | 52512 | |
| Syringe | Hamilton | 7657-01 | 250 μL |
| Needle | Hamilton | 7780-01 | 26s Gauge, Blunt end removable needle |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702208 | 11Plus |
| Digital Caliper | Carrera | CP5906 | 0-150 mm range |
| Stainless steel forceps | World Precision Instruments | 501764 | Mini Dumont #M5S |
| Motor | Nature Mill | 7090529 | 12VDC, 2 rpm speed |
| Linear Actuator | Warner Electric | 01-D024-0050-A06-LP-IP65 | 24VDC, 6 inch range |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| Digital microscope camera | Leica Microsystems | DFC320 | Software: Leica Application Suite v2.8.1 |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | 500260 | |
| Microtensometer | Aurora Scientific | 310C | 5N Dual-Mode System |
References
- Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S., Savage, K. N. The mechanical design of spider silks: from fibroin sequence to mechanical function. J. Exp. Biol. 202, 3295-3303 (1999).
- Foelix, R. . Biology of spiders. , (1996).
- Vollrath, F., Knight, D. P. Liquid crystalline spinning of spider silk. Nature. 410, 541-548 (2001).
- Spiess, K., Lammel, A., Scheibel, T. Recombinant spider silk proteins for applications in biomaterials. Macromol. Biosci. 10, 998-1007 (2010).
- Stark, M., Grip, S., Rising, A., Hedhammar, M., Engstrom, W., Hjalm, G., Johansson, J. Macroscopic fibers self-assembled from recombinant miniature spider silk proteins. Biomacromolecules. 8, 1695-1701 (2007).
- Lazaris, A., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider Silk Fibers Spun from Soluble Recombinant Silk Produced in Mammalian Cells. Science. 295, 472-476 (2002).
- Teule, F., Cooper, A. R., Furin, W. A., Bittencourt, D., Rech, E. L., Brooks, A., Lewis, R. V. A protocol for the production of recombinant spider silk-like proteins for artificial fiber spinning. Nat. Protoc. 4, 341-355 (2009).
- Gnesa, E., Hsia, Y., Yarger, J. L., Weber, W., Lin-Cereghino, J., Lin-Cereghino, G., Tang, S., Agari, K., Vierra, C. Conserved C-Terminal Domain of Spider Tubuliform Spidroin 1 Contributes to Extensibility in Synthetic Fibers. Biomacromolecules. , (2011).
- Hayashi, C. Y., Shipley, N. H., Lewis, R. V. Hypotheses that correlate the sequence, structure, and mechanical properties of spider silk proteins. Int. J. Biol. Macromol. 24, 271-275 (1999).
- Xu, M., Lewis, R. V. Structure of a protein superfiber: Spider Dragline Silk. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7124 (1990).
- Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. Molecular and mechanical characterization of aciniform silk: uniformity of iterated sequence modules in a novel member of the spider silk fibroin gene family. Mol. Biol. Evol. 21, 1950-1959 (2004).
- Lazaris, A., Arcidiacono, S., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science. 295, 472-476 (2002).
- Arcidiacono, S., Mello, C., Kaplan, D., Cheley, S., Bayley, H. Purification and characterization of recombinant spider silk expressed in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 31-38 (1998).
- Menassa, R., Zhu, H., Karatzas, C. N., Lazaris, A., Richman, A., Brandle, J. Spider dragline silk proteins in transgenic tobacco leaves: accumulation and field production. Plant Biotechnology Journal. 2, 431-438 (2004).
- Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nat. Biotechnol. 19, 573-577 (2001).
- An, B., Hinman, M. B., Holland, G. P., Yarger, J. L., Lewis, R. V. Inducing beta-sheets formation in synthetic spider silk fibers by aqueous post-spin stretching. Biomacromolecules. 12, 2375-2381 (2011).
- Elices, M., Guinea, G. V., Plaza, G. R., Karatzas, C., Riekel, C., Agullo-Rueda, F., Daza, R., Perez-Rigueiro, J. . Bioinspired Fibers Follow the Track of Natural Spider Silk. Macromolecules. 44, 1166-1176 (2011).
- Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nature Biotechnology. 19, (2001).
- Kojic, N., Kojic, M., Gudlavalleti, S., McKinley, G. Solvent removal during synthetic and Nephila fiber spinning. Biomacromolecules. 5, 1698-1707 (2004).
- Jeffery, F., La Mattina, C., Tuton-Blasingame, T., Hsia, Y., Gnesa, E., Zhao, L. Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands. J. Vis. Exp. (47), e2382 (2011).
- Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L., Falick, A. M., Zhao, L., Fong, J., Vaidyanathan, V., Visperas, A., Geurts, P., Hu, X., La Mattina, C., Vierra, C. Pyriform spidroin 1, a novel member of the silk gene family that anchors dragline silk fibers in attachment discs of the black widow spider, Latrodectus hesperus. J. Biol. Chem. 284, 29097-29108 (2009).
- La Mattina, C., Reza, R., Hu, X., Falick, A. M., Vasanthavada, K., McNary, S., Yee, R., Vierra, C. A. Spider minor ampullate silk proteins are constituents of prey wrapping silk in the cob weaver Latrodectus hesperus. Biochimie. 47, 4692-4700 (2008).
- Hsia, Y., Gnesa, E., Jeffery, F., Tang, S., Vierra, C., Cuppoletti, J. Spider Silk Composites and Applications. Metal, Ceramic and Polymeric Composites for Various Uses. 2, 303-324 (2011).
