Elektrisitet-Free, Sekvensiell nukleinsyre-og Protein Isolation

Summary

Et verktøy og kjemi er beskrevet til sekvensielt isolere nukleinsyrer etterfulgt av proteiner fra en prøve uten behov for elektrisitet. Verktøyet består av en sorbent avholdes innen en overføringspipetten mens isolasjon kjemi er basert på solid-fase uttak prinsipper. De isolerte makromolekyler kan analyseres ved immuno-baserte og PCR-baserte analyser.

Abstract

Tradisjonelle og nye patogener som Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis eller prion-baserte sykdommer er av stor betydning for regjeringer, industrier og medisinske fagfolk verden over. For eksempel, EHECs, kombinert med Shigella, er ansvarlig for drapene på ca 325 000 barn hvert år, og er særlig utbredt i den tredje verden hvor laboratorie-basert identifisering, vanlig i USA, er utilgjengelig ^en. Utvikling og distribusjon av lave kostnader, kan felt-basert, point-of-care verktøy for å hjelpe til med rask identifisering og / eller diagnose av patogener eller sykdomsmarkører dramatisk endre sykdomsutvikling og pasient prognose. Vi har utviklet et verktøy for å isolere nukleinsyrer og proteiner fra en prøve av solid-fase ekstraksjon (SPE) uten strøm eller tilknyttet laboratorieutstyr ^to. De isolerte makromolekyler kan brukes til diagnosesis enten i en fremskutt lab eller bruke feltbaserte point-of-care plattformer. Viktigere, gir denne metoden for direkte sammenligning av nukleinsyre-og protein data fra en un-split prøven, og tilbyr en tillit gjennom bekreftelser av genomisk og proteomikk analyser.

Vår isolasjon verktøy benytter bransjestandard for fast-fase nukleinsyre isolasjon, bommen teknologien, som isolerer nukleinsyrer fra en chaotropic salt løsning, vanligvis Guanidine isothiocyanate, gjennom binding til silika-baserte partikler eller filtre ^3. CUBRC proprietære fast-fase ekstraksjon kjemi brukes til å rense protein fra chaotropic saltløsninger, i dette tilfellet fra avfall eller flyt-thru etter nukleinsyre isolasjon ^4.

Ved emballasje godt karakterisert kjemi i en liten, billig og enkel plattform, har vi generert et bærbart system for nukleinsyre og protein utvinning som kan utføres under en variety forhold. De isolerte nukleinsyrer er stabile og kan transporteres til en posisjon der strøm er tilgjengelig for PCR amplifikasjon mens proteininnholdet kan umiddelbart bli analysert av håndholdt eller andre immunologiske-baserte analyser. Den raske identifisering av sykdomsmarkører i feltet kunne signifikant påvirker pasientens utfallet ved å dirigere riktig løpet av behandling på et tidligere stadium av sykdommen progresjon. Verktøyet og metoden beskrevet er egnet for bruk med alle typer smittestoff og tilbyr brukeren redundans av multi-macromolecule typen analyser samtidig redusere sitt logistiske byrde.

Protocol

1. Eksempel Lysis Prøver bør være i flytende form. Hvis prøven er solid, for eksempel mat eller avføring, bør prøven være opphengt i en flytende medier som for eksempel vann eller fosfatbufret saltvann (PBS). Bland 500 mL av prøven med 500 mL av 6M Guanidine Thiocyanate (pH 6,5) i en 1,5 ml rør. Tråkk pære av en utvinning pipette, utvise luften. Trekk hele 1 ml prøve til utvinning pipette over sorbent materiale, ved at pæren til sakte utvide. Snu utvinning verktøyet slik at sorbent perler og prøve dreneres til pære. Slip sorbent perler med prøven i pæren være forsiktig med å utvise prøven ut av utvinning pipetten. 2. Nukleinsyre Utvinning (Figur 1, Panel A) Snu utvinning pipetten (åpning nedover) og utvise prøven til den opprinnelige 1,5 ml tube. <li> Trekk hele 1 ml prøve til utvinning pipetten, passerer over sorbent, i et moderat tempo, være nøye med å holde sorbent i halsen på utvinning pipetten. Utvise hele utvalget til 1,5 ml rør ved å trykke på pære. Gjenta trinn 2.2 og 2.3, bestått prøven over sorbent fire flere ganger for totalt 5 omganger. Etter den femte pass over sorbent, fordrive hele 1 ml prøve til 4ml av proteinet utvinning buffer (i en 15 ml konisk tube), lukke røret, og satt til side for senere bruk. Vask de isolerte nukleinsyrer ved å passere 1 mL 95% etanol over sorbent tre ganger, returnere etanol til sin opprinnelige røret ved endelig passasje. Gjenta trinn 2.6 bruker en andre 1 mL, 95% etanol vask. Trykk og slipp pære i 5 minutter, passerer luft gjennom utvinning pipetten til å tørke nukleinsyrer / sorbent bed. Tørk gjenværende etanol fra spissen av utvinning pipetten usynge en Kimwipe. Gjenopprette nukleinsyrer ved å passere 250 mL av 10 mM Tris (pH 6,8) over de sorbent fem ganger. Den Tris buffer kan erstattes av noen annen egnet vandig løsning som PBS. Den resulterende løsningen inneholder de utpakkede nukleinsyrer. 3. Protein Utvinning (Figur 1, Panel B) Bland prøven og protein utvinning buffer tube fra trinn 2,5 ved inversjon og passerer omtrent to til tre milliliter denne 5 mL prøve over sorbent av en ny utvinning pipette. Utvise hele utvalget i samme 15ml konisk tube er forsiktig med å holde sorbent i halsen på utvinning pipetten. Gjenta trinn 3.1 og 3.2, bestått prøven over sorbent 15 ganger. Vask sorbent og det bundne protein ved å sende en ml av 95% etanol over sorbent senga tre ganger, mate ut etanol inn i det opprinnelige røret. Gjenta trinn 3.4 bruker en andre 1 mL, 95% etanol vask. Trykk og slipp pære i 5 minutter, passerer luft gjennom utvinning pipetten til å tørke protein / sorbent seng. Tørk gjenværende etanol fra spissen av utvinning pipetten med en kimwipe. Gjenopprette proteinet ved å sende 250 mL PBS over sorbent fem ganger. PBS buffer kan erstattes av noen annen egnet vandig løsning, for eksempel 10 mM Tris (pH 6,8). Den resulterende løsningen inneholder proteininnholdet i prøven. Figur 1. Figur 2. Figur 3. Figur 4. innhold "> Figur 5.

Representative Results

Nukleinsyre Isolasjon: Isolerte nukleinsyrer er PCR amplifibart og fri for protein forurensning. Eksempel 1: De gjenopprettede nukleinsyrer er egnet for bruk i PCR-baserte applikasjoner. For eksempel viser figur 2 forsterkningen av shigatoksin gener assosiert med Enterohemorrhagic E. coli O157: H7 stamme EDL-933 (ATCC # 35150) fra en nukleinsyre / protein utvinning prosedyren med utvinning pipette. De shigatoksin genene STX 1 og STX to blir funnet på temperert Lambda-aktig bakteriofag og defekt bakteriofag i denne og andre Enterohemorrhagic E. coli-stammer under kontroll av P R arrangøren 5 6 7 8. Aktivering av SOS respons i E. coli fører til prophage induksjon og / eller toksin produksjon ni. Vi har benyttet en modifisert versjon av multiplekset PCR assay av Feng et al. 1En å identifisere STX 1 og STX 2 gener i både kultur og piggete kloakk prøver. Lanes A og B i figur 2 viser resultatene av en PCR amplifikasjon av en ubehandlet kultur sample (kjørefelt A) og en bearbeidet kultur prøve (kjørefelt B). Disse resultatene er tilnærmet identiske mening er det ingen tap av gjengivelse i det bearbeidede eller isolerte nukleinsyrer. Vi neste forsterket spiked rå kloakk (kjørefelt D) eller isolerte nukleinsyrer fra spiked kloakk (kjørefelt E & F). Disse dataene indikerer at de isolerte nukleinsyrer resultert i større forsterkning versus de ikke-isolerte nukleinsyrer fra piggete kloakk prøver. Vi konkluderer derfor med at enten PCR-hemmere naturlig finnes i kloakk ble fjernet på isolasjon eller at nukleinsyrer ble konsentrert på isolasjon. En kombinasjon av disse to hypotesene er også mulig. Ultrafiolett spektroskopi ble siden brukt til å vise at de isolerte nukleinsyrer var relativt fri of forurensende protein. Figur 3 viser UV spektra av to E. coli O157: H7 nukleinsyre ekstraksjoner, merket isolasjon en og isolasjon b, i forhold til normalisert spekteret av bakteriekultur, merket pre-isolasjon. UV spektra av isolerte nukleinsyrer ligner spektra av rene nukleinsyrer, har en beregnet forholdet mellom absorbans mellom 260 nm og 280 nm nærmer 1,8 10. Disse dataene viser at det er svært lite forurensende protein i nukleinsyre fraksjonen som ble gjenfunnet ved hjelp av teknikken beskrevet. Protein Isolation: Gjenopprettet protein fra nukleinsyre / protein isolasjon eksperiment er immunoreactive og electrophoretically identisk til ren protein. Eksempel 2: Den isolerte proteinfraksjon ble brukt på RapidChek E. coli O157 lateral strømning analysen strimler (SDIX, Inc.). Kontroller viser en positiv identifikasjon i alle prøvene huser E. coli O157, med eller uten STX induksjon (figur 4, baner B og C, henholdsvis). Dataene i figur 4 viser også positive resultater for de prøvene huser E. coli O157 som ble behandlet for nukleinsyrer og deretter protein ved hjelp av utvinning pipetten. Disse dataene viser at den isolerte proteinet fra hver prøve er immunoreactive dermed utløser en positiv respons. PCR amplifikasjon (som beskrevet i Eksempel 1) ble utført på protein prøver å vise at den isolerte proteinfraksjon var blottet for forurensende nukleinsyrer. Resultatene for disse eksperimentene var alle negative ved gel elektroforese. Derfor konkluderer vi at proteininnholdet i prøven ble skilt fra forurensende nukleinsyrer. Disse resultatene, tatt i hel med de beskrevet for nukleinsyre isolasjon STEP viser at nukleinsyrer og protein innhold er isolert i separate fraksjonering trinn. t "> Eksempel 3:. Den isolerte protein er egnet for elektroforese 10 Figur 5 viser en Coomassie beiset 8% akrylamid gel lastet med BSA (Figur 5, kjørefelt A & C) og BSA isolert fra 6M Guanidine isothiocyanate med utvinning pipette og tilhørende protokoll. Den elektroforetiske mobilitet av isolerte proteinet er identisk med de kontrollprøver. Dermed har vi konkludere med at den utpakkingen ikke endrer det kovalente strukturen i isolerte protein. Figur 1, Panel A: Visning av en typisk nukleinsyre ekstraksjonsmetode Prøven blandes med 6M Guanidine thiocyanate i prøverøret og bestått i løpet av de sorbent fem ganger.. Etter den siste passasjen, er prøven lagt til protein utvinning buffer. De sorbent og bundet nukleinsyrer blir vasket to ganger med etanol. Prøven er da luft dRied og elueres fra sorbent. Figur 1, Panel B: Visning av en typisk protein ekstraksjonsmetode Prøven blandes med protein isolasjon buffer fra trinn 1, Figur 1, panel A gikk over sorbent av et sekund utvinning pipette 15 ganger.. Resten av prosedyren er identisk med den nukleinsyre utvinning protokollen. Figur 2:. Negativt bilde av en etidiumbromid beiset agarose gel en multiplekset shigatoksin 1 og 2 genamplifisering Forsøket ble utført ved hjelp av kultur prøver (baner A og B) eller rå kloakk prøver tilsatt E. coli O157: H7 (baner D, E og F). Prøvene ble enten direkte lagt til en PCR reaksjon tube (baner A og D) eller prøvene ble behandlet ved hjelp av isolasjon process og de utpakkede nukleinsyrer ble lagt til PCR reaksjonen tube (Samples B, E og F). PCR-protokollen er en modifisering av en beskrevet av Feng et al 11. Vår modifikasjon rettet bare de forsterkes av STX 1 (lavere band) og STX 2 (øvre bånd) primer parene, slippe ut alle andre primer par. Lane C er 1KB stigen fra BioRad. Figur 3: UV-spektroskopi resultater av E. coli O157: H7 nukleinsyrer isolert ved hjelp av den rapporterte utvinningen pipetten De isolerte nukleinsyrer er merket isolasjon en og isolasjon b… UV spekteret av prøven ble også testet før nukleinsyre utvinning og er merket pre-isolasjon. Spektrene ble innhentet ved hjelp av en Hitachi U3010 spektrofotometer og tilhørende programvare pakke. <br/> Figur 4:. Fargefoto av RapidChek teststrimler proteininnholdet i prøvene som brukes i Figur 2 ble isolert ved hjelp av ekstraksjon pipetten og testet for immuno-reaktivitet av laterale flyten analysen. Lanes AC er ubehandlet kontroller, som er, ble cellekultur lagt til strimmelen uten nukleinsyre eller protein utvinning. Lane A er E. coli-BL21 DE3 pLysS som en negativ kontroll, Lanes B og C viser E. coli O157: H7 som var ubehandlet (B), eller behandlet med mitomycin C i 4 timer (C). Lanes D gjennom H viser resultatene av å legge de utpakkede protein til de laterale flyt strimlene. Lanes D og E ble analysert ved hjelp av protein ekstrakt fra E. coli BL21 DE3 pLysS enten uten (D) eller med mitomycin C behandling (E) som negative kontroller. Lanes FH viser resultatene når hentet protein fra E. coli O157: H7 ble brukt. Protein ble hentet fra ubehandlet (F), eller fra 2 time (G) eller 4 timer (H) mitomycin C behandlet kulturer.Positive resultater produsere en dobbel rød linje. Figur 5:. Fotografi av en Coomassie beiset SDS-PAGE BSA ble isolert fra løsningen ved hjelp av ekstraksjon pipetten og beskrevet protokoller. Lanes A og C er kontroll baner på 250 mikrogram / ml og 500 mg / ml henholdsvis. Lanes B og D avbilde utvinnes BSA fra løsninger som inneholder de samme konsentrasjoner som sine respektive kontroller.

Discussion

Verktøyet, kjemi og protokoll beskrevet i denne rapporten representerer den første kjente eksempel på en strøm-fritt, multi-macromolecule utvinning system som kan utnyttes i felt-basert, point-of-care applikasjoner. Begge macromolecule typene kan brukes til en rekke nedstrøms diagnostiske eller analytisk enheter. For eksempel, de isolerte nukleinsyrer er av PCR kvalitet (figur 2 og 3) mens protein komponent i prøven er immunoreactive (figur 4). Utnyttelsen av dette utvinning systemet i streng eller ressurs begrensede områder av verden kunne drastisk redusere sykdomsbyrden i befolkningen som bor der. Dette utvinning system kan også hjelpe i sykdomsovervåking programmer over hele verden ved å tilby en robust, men rask og kostnadseffektiv metode for prøvebehandling i streng eller avsidesliggende steder.

Et viktig aspekt til utvinning metoden skissert ovenfor, er atden kan endres av brukeren. For eksempel i tilfeller der utvalg er større eller mindre enn de første 500 μLs (trinn 1,2), kan brukeren justere volumet på reagensene tilsvarende. Det vil si at den volumetriske forholdet mellom reagensene til størrelsen på utvalget bør forbli konstant, mens de absolutte volumene kan endres. Dessuten kan justeringer i antall passeringer over sorbent også gjøres på brukerens skjønn. For eksempel, hvis en større prøvevolum brukes, passerer prøven over sorbent flere ganger enn notert (trinn 2,4 & 3.3) vil øke sannsynligheten for at macromolecule type (nukleinsyre eller protein) kontakte sorbent. Økningen i passasjer bør øke fange effektiviteten til sorbent metning er nådd.

Vi har funnet at utvinning verktøyet og tilhørende kjemi har noen begrensninger, den mest betydningsfulle av dem er at proteinet utvinning kjemi er ineffektivt for gjenvinning av svært glykosylertproteiner. I det tilfelle at nedstrøms diagnostiske mål en glykosylert protein, kan dette systemet ikke være ideelt for identifikasjon. I tillegg er øvre og nedre grense for uttak effektivitet for enten nukleinsyrer eller proteiner fortsatt bestemmes, og optimalisering er igangsatt for å maksimere utvinningen effektivitet. Videreutvikling av verktøyet vil overvinne disse dagens kunnskapshull.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Guanidine Thiocyanate	Teknova	G4000
ethanol	Pharmco-Aaper	11ACS200
2-propanol	Sigma-Aldrich	109827-1L
BSA	Sigma	A-4503