La purification et l'agrégation de la protéine précurseur amyloïde domaine intracellulaire
Summary
Une méthode pour purification à grande échelle du domaine intracellulaire APP (AICD) est décrite. Nous décrivons également une méthodologie pour induire<em> In vitro</em> AICD l'agrégation et la visualisation par microscopie à force atomique. Les méthodes décrites sont utiles pour la caractérisation biochimique / structurelle de l'AICD et les effets de chaperons moléculaires sur son agrégation.
Abstract
La protéine précurseur de l'amyloïde (APP) est une protéine transmembranaire de type I associée à la pathogenèse de la maladie d'Alzheimer (MA). APP est caractérisé par un grand domaine extracellulaire et un domaine cytoplasmique court appelé le domaine intracellulaire APP (AICD). Au cours de maturation à travers la voie sécrétoire, l'APP peut être clivée par des protéases appelées α, β, γ-sécrétase et 1. Séquentiel clivage protéolytique de l'APP et de β γ-sécrétase conduit à la production d'un peptide protéolytique petit Aß appelé, qui est amyloïdogénique et le constituant de noyau de plaques séniles. L'AICD est aussi libérée de la membrane après traitement sécrétase, et à travers les interactions avec Fe65 et Tip60, peut translocation vers le noyau de participer à la régulation de la transcription de gènes cibles multiples 2,3. Interactions protéine-protéine impliquant l'AICD peut affecter le trafic, le traitement et les fonctions cellulaires de holo-APP et son C-termifragments al. Nous avons récemment montré que l'AICD peut agrégat in vitro, et ce processus est inhibé par le ubiquilin-1-AD en cause chaperon moléculaire 4. Conformément à ces résultats, l'AICD a mis en évidence des domaines hydrophobes et est intrinsèquement désordonnés in vitro 5,6, mais il obtient une structure secondaire stable lorsqu'elle est liée à Fe65 7. Nous avons proposé que ubiquilin-1 empêche inappropriées interactions inter-et intramoléculaire de l'AICD, empêchant l'agrégation in vitro et dans des cellules intactes 4. Alors que la plupart des études portent sur le rôle de l'APP dans la pathogénie de la MA, le rôle de l'AICD dans ce processus n'est pas clair. Expression de l'AICD a été montré pour induire l'apoptose 8, pour moduler les voies de signalisation 9, et de réguler la signalisation calcique 10. La surexpression de l'AICD et Fe65 dans un modèle de souris transgénique induit la maladie d'Alzheimer, comme la pathologie 11, et récemment l'AICD a été détecté en soutien-gorgedans les lysats par western blot en utilisant des techniques appropriées de récupération d'antigène 12. Pour faciliter les études structurales, biochimiques et biophysiques de l'AICD, nous avons développé une procédure pour produire des quantités importantes de protéine recombinante AICD très pur. En outre, nous décrivons une méthode pour induire l'agrégation de vitro thermique de l'AICD et l'analyse par microscopie à force atomique. Les méthodes décrites sont utiles pour la caractérisation biochimique, biophysique et structurale de l'AICD et les effets de chaperons moléculaires sur l'agrégation AICD.
Protocol
Discussion
Dans ce protocole, nous avons décrit une procédure pour l'obtention de l'AICD très pur pour analyses structurales, biophysiques et biochimiques. Cette procédure ne nécessite pas de matériel sophistiqué et chromatographie est donc accessible à la plupart des laboratoires. D'autres groupes ont purifié AICD 5-7,16, y compris la TPS-AICD 17-19, pour des analyses biochimiques / structurelle. Inconvénients aux protocoles précédents incluent une mauvaise solubilité de l'AICD <…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Hui Zheng (Baylor College of Medicine) pour l'APP ADNc. Ce travail a été financé par des subventions du NIH R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), le Mémorial John Sealy Fonds de dotation pour la recherche biomédicale (AFO), et le C. Jean et William D. Willis de recherche en neurosciences de dotation (ESS). JMB est un savant dans le programme de recherche translationnelle Scholar et un membre de l'Université du Texas Medical Branch Claude E. Pepper Centre ancien indépendance Américains (soutenu par des subventions du NIH UL1RR029876 et P30-AG-024 832, respectivement).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| pGEX-4T-1 | GE Healthcare | 28-9545-49 | |
| Thrombin | GE Healthcare | 27-0846-01 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Bradford protein assay reagent | Bio-Rad | 500-0002 | |
| Coomassie blue | Bio-Rad | 161-0786 | |
| IPTG ( isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Glutathione-agarose | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| p-aminobenzamidine-agarose | Sigma-Aldrich | A7155 | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66380 | |
| Chromatography columns | Evergreen Scientific | 208-3367-050 | |
| Emulsifier | Avestin, Inc | EmulsiFlex-C3 | Highly recommended |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670107 | |
| Mica Disks | Ted Pella | 50-12 | |
| AFM cantilevers | Bruker | MSNL-10 | |
| WSxM software | Nanotec | N/A | Free download |
References
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