La purificación y la agregación de la proteína precursora amiloide del dominio intracelular
Summary
Un método para la purificación a gran escala del dominio intracelular de APP (AICD) se describe. También describe la metodología para inducir<em> In vitro</em> AICD agregación y visualización por microscopía de fuerza atómica. Los métodos descritos son útiles para la caracterización bioquímica / estructural de la AICD y los efectos de las chaperonas moleculares en su agregación.
Abstract
Proteína precursora de amiloide (APP) es una proteína transmembrana de tipo I asociado con la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer (AD). APP se caracteriza por un gran dominio extracelular y un dominio citosólico corto denominado el dominio intracelular de APP (AICD). Durante la maduración a través de la vía secretora, APP puede ser escindida por proteasas denominadas α, β, y γ-secretasas 1. La escisión proteolítica de APP secuencial con β y γ-secretasas conduce a la producción de un péptido pequeño proteolítica, Aß denomina, que es amiloidogénica y el constituyente principal de las placas seniles. La AICD también es liberado de la membrana después de la elaboración secretasa, y a través de las interacciones con Fe65 y Tip60, puede trasladar al núcleo de participar en la regulación de la transcripción de genes diana múltiples 2,3. Interacciones proteína-proteína que implican la AICD pueden afectar el tráfico, el procesamiento y las funciones celulares de holo-APP y su C-terminfragmentos col. Recientemente hemos demostrado que puede AICD agregado in vitro, y este proceso se inhibe por la ubiquitina-1 AD-implicado chaperona molecular 4. Consistente con estos hallazgos, la AICD ha expuesto dominios hidrófobos y está intrínsecamente desordenados in vitro 5,6, sin embargo se obtiene una estructura secundaria estable cuando está unido a Fe65 7. Hemos propuesto que la ubiquitina-1 previene apropiado interacciones inter-e intramolecular de la AICD, prevenir la agregación in vitro y en células intactas 4. Mientras que la mayoría de los estudios se centran en el papel de APP en la patogénesis de la EA, el papel de la AICD en este proceso no está claro. Expresión de AICD se ha demostrado que induce la apoptosis 8, para modular las vías de señalización 9, y para regular la señalización de calcio 10. La sobreexpresión de la AICD y Fe65 en un modelo de ratón transgénico induce patología de Alzheimer como 11, y recientemente AICD se ha detectado en el sujetadoren lisados por Western Blot utilizando las técnicas apropiadas de recuperación de antígeno 12. Para facilitar estudios estructurales, bioquímicos y biofísicos de la AICD, se ha desarrollado un procedimiento para producir cantidades grandes de proteína recombinante AICD altamente puro. Nos describen además un método para inducir la agregación en vitro térmica de AICD y el análisis por microscopía de fuerza atómica. Los métodos descritos son útiles para la caracterización bioquímica, biofísica y estructural de la AICD y los efectos de las chaperonas moleculares sobre la agregación de AICD.
Protocol
Discussion
En este protocolo hemos descrito un procedimiento para la obtención de DAI de alta pureza para análisis estructurales, biofísicos y bioquímicos. Este procedimiento no requiere un equipo sofisticado y cromatografía es por tanto accesible a la mayoría de los laboratorios. Otros grupos han purificado AICD 5-7,16, incluyendo GST-AICD 17-19, para los análisis bioquímicos / estructural. Las desventajas de los protocolos anteriores incluyen mala solubilidad de AICD 16, menos de pureza i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Dr. Hui Zheng (Baylor College of Medicine) para la APP cDNA. Este trabajo fue financiado por el NIH subvenciones R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), el Memorial Juan Sealy Fondo de Dotación para la Investigación Biomédica (AFO), y el C. Jean y William D. Willis Fundación de Investigación de Neurociencia (ESS). JMB es un erudito en el Programa de Investigación Traslacional Académico y miembro de la Universidad de Texas Medical Branch Claude E. Pepper Older Independencia estadounidenses Center (apoyado por el NIH subvenciones UL1RR029876 y P30-AG-024.832, respectivamente).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| pGEX-4T-1 | GE Healthcare | 28-9545-49 | |
| Thrombin | GE Healthcare | 27-0846-01 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Bradford protein assay reagent | Bio-Rad | 500-0002 | |
| Coomassie blue | Bio-Rad | 161-0786 | |
| IPTG ( isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Glutathione-agarose | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| p-aminobenzamidine-agarose | Sigma-Aldrich | A7155 | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66380 | |
| Chromatography columns | Evergreen Scientific | 208-3367-050 | |
| Emulsifier | Avestin, Inc | EmulsiFlex-C3 | Highly recommended |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670107 | |
| Mica Disks | Ted Pella | 50-12 | |
| AFM cantilevers | Bruker | MSNL-10 | |
| WSxM software | Nanotec | N/A | Free download |
References
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