Différencier les rôles fonctionnels de l'expression des gènes de cellules immunitaires et non immunitaires dans l'intestin de souris par greffe de moelle osseuse

Summary

La greffe de moelle osseuse fournit un moyen de changer le génotype des cellules de moelle osseuse dérivées. Si le gène d'intérêt est exprimé dans les deux cellules de moelle osseuse et les cellules dérivées de moelle osseuse non dérivés, la greffe de moelle osseuse peut modifier les cellules de moelle osseuse provenant d'un génotype différent sans modifier le génotype non-cellulaire de la moelle osseuse extraite.

Abstract

Pour comprendre le rôle d'un gène dans le développement de la colite, nous avons comparé les réponses des souris de type sauvage et sur les gènes d'intérêts souris knockout déficientes à la colite. Si le gène d'intérêt est exprimé dans les deux cellules de moelle osseuse et de cellules dérivées de moelle osseuse non dérivés de l'hôte, mais il est possible de différencier le rôle d'un gène d'intérêt dans des cellules de moelle osseuse dérivées et non de la moelle osseuse des cellules dérivées de la technique de transplantation de moelle osseuse. Pour changer la moelle osseuse de cellules dérivées du génotype des souris, la moelle osseuse d'origine des souris receveuses ont été détruites par l'irradiation, puis remplacé par un nouvel os moelle du donneur du génotype différent. Lorsque de type sauvage moelle osseuse du donneur souris a été transplanté à des souris knock-out, nous avons pu générer des souris knock-out avec l'expression du gène de type sauvage dans des cellules de moelle osseuse dérivées. Alternativement, lorsque les souris knock-out moelle osseuse du donneur a été transplanté à des souris de type sauvage bénéficiaires, souris de type sauvage sans gène d'intérêt exprimantde la moelle osseuse des cellules dérivées ont été produites. Cependant, la greffe de moelle osseuse peut ne pas être 100% complet. Par conséquent, nous avons utilisé cluster de différenciation (CD) molécules (CD45.1 et CD45.2) comme marqueurs de cellules du donneur et du receveur de suivi de la proportion de cellules de moelle osseuse du donneur provenant de souris receveuses et la réussite de la greffe de moelle osseuse. Souris de type sauvage avec des souris knock-out et génotype CD45.1 avec CD45.2 génotype ont été utilisés. Après l'irradiation des souris receveuses, les cellules du donneur de moelle osseuse de différents génotypes ont été infusée dans les souris receveuses. Lorsque la moelle osseuse nouvelle régénérée pour reprendre son immunité, les souris ont été provoquées par un agent chimique (sulfate de sodium dextrane, le MAS 5%) pour induire une colite. Ici, nous avons également montré la méthode pour induire une colite chez la souris et d'évaluer le rôle du gène d'intérêt exprimé à partir de la moelle osseuse des cellules dérivées. Si le gène d'intérêt dans les cellules osseuses dérivées joue un rôle important dans le développement de la maladie (comme Escherichiatis), le phénotype des souris receveuses avec greffe de moelle osseuse peut être significativement modifiée. À la fin des expériences colite, la moelle osseuse de cellules dérivées dans le sang et la moelle osseuse ont été marquées avec des anticorps contre CD45.1 et CD45.2 et leur rapport quantitatif de l'existence pourrait être utilisée pour évaluer la réussite de la greffe de moelle osseuse par cytométrie en flux. Succès de la transplantation de moelle osseuse doit montrer une grande majorité de génotype donneur (en terme de marqueur molécule CD) sur le génotype destinataire à la fois dans la moelle osseuse et le sang des souris receveuses.

Protocol

1. Avant-vous-start Considérations techniques Nous vous recommandons d'utiliser les deux C57/BL6 souris de type sauvage et des souris knock-out pour l'expérience parce que les souris avec des molécules CD correspondantes peuvent être achetés auprès de fournisseurs majeurs de souris. Comme il est difficile de suivre les souris de type sauvage et des souris knock-out dérivées des cellules du donneur après transplantation de moelle osseuse, il est nécessaire d'utiliser des souris …

Representative Results

Si le gène d'intérêt joue un rôle important dans les cellules immunitaires au cours du développement de la colite, les souris recevant la moelle osseuse de génotype différent par greffe de moelle osseuse (WT KO ou KO à WT) devrait avoir une altération de la réponse à la colite DSS. L'un des paramètres les plus importants pour déterminer la gravité de la colite est la coloration H & E des tissus coliques. Changements dans la structure des tissus du côlon et des signes d'inflammation peut ê…

Discussion

Cette approche greffe de moelle osseuse est adapté à la recherche d'immunologie de la colite, une infection, le cancer, l'obésité et d'autres maladies. Cette expérience greffe de moelle osseuse est nécessaire lorsque le gène d'intérêt est exprimé à la fois dans la moelle osseuse dérivées et les cellules de moelle osseuse non dérivés et le gène d'intérêt est soupçonnée de servir de médiateur maladie par les cellules de la population soit. Par exemple, peptide antimicrobien cathél…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Cell staining buffer	Biolegend	#420201
10X RBC lysis buffer	Biolegend	#420301
FITC mouse isotype control	Biolegend	#400207
PE mouse isotype control	Biolegend	#400211
PE anti-mouse CD45.2	Biolegend	#109807
FITC anti-mouse CD45.1	Biolegend	#110705
Anti-mouse CD16/32 blocking	Biolegend	#101301
40 μm cell strainer	Fisherbrand	#22363547
PBS 1X	MP biomedicals	#1860454
Heparin	Fisherbrand	#BP2425
Sulfatrim (SMZ)	Qualitest	NC9242720 (fisher)
Lysol IC	Andwin Scientific	NC9745686 (fisher)
Vaccutainer	BD	#8000813
Mouse restrainer	Braintree Scientific	#TV-150
Irradiator	J.L. Shepherd and Associates	Mark I 68A
Flow cytometer	BD	BD FACSCanto II
Flow cytometer test tube	Falcon	#352052
Digital caliper	Fisherbrand	14-648-17
Hemoccult ICT	Beckman Coulter	G0328QW