在GFP标记的下丘脑神经元的小鼠脑片成像钙反应
Summary
在这个协议中，我们更新了最新进展，成像钙<sup> 2 +</sup>绿色荧光蛋白标记的神经元在脑组织切片，使用红色荧光钙信号<sup> 2 +</sup>指示剂染料。
Abstract
在我们的知识尽管一个巨大的增加有关的机制，在大脑中的信息的编码，一个中心问题的确切分子步骤，以及特定的神经元的活性，在如下丘脑保持脑区的多功能核。这个问题包括参与各种神经激素信号转导通路的调节成分的分子识别。立面图细胞内Ca 2 +在调节神经元的敏感性，发挥重要的作用，无论是在水平的信号转导，和在突触站点。
出现了新的工具，以帮助识别特定的启动子的控制下表达绿色荧光蛋白（GFP）无数的神经元在大脑的神经元。若要监视空间和时间上的刺激诱 导的Ca 2 +的响应在GFP-标记的神经元，非绿色荧光的Ca 2 +指示剂染料Ň要使用的电火工品。此外，激光共聚焦显微镜是一个喜爱的成像单个神经元的方法，由于其能力，可视化神经元的组织内，并在不同的平面的深度限制满分的聚焦荧光组织切片。比例式的Ca 2 +指示剂fura-2的组合已被用于与GFP标记的神经元1。然而，染料通过紫外线（UV）光被激发。 UV光的激光和光穿透深度有限的成本阻碍了它的使用在许多实验室中。此外，GFP荧光可能会干扰与fura-2的信号2。因此，我们决定使用红色荧光的Ca 2 +指示剂染料。巨大的笔画呋喃红色移位允许使用一个单一的激发波长与GFP组合的红色荧光的多色分析。我们有以前了良好的效果，使用呋喃结合红色与绿色荧光蛋白标记的嗅觉神经元。嗅觉组织切片的协议似乎工作电子邮件qually下丘脑神经元。呋喃红色的Ca 2 +成像也成功地结合GFP标记的胰岛β细胞和GFP标记的受体表达的HEK细胞5,6。一个小怪癖的呋喃红是在650 nm，其荧光强度降低，一旦指标结合钙7。因此，具有相对高的静息神经元低的Ca 2 +浓度的荧光强度。应当指出，红色，其他Ca 2 +的指示剂染料存在的或正在开发的，这可能给在不同的神经元和大脑区域更好的或改进的结果。
Protocol
1。解决方案和琼脂糖凝胶的制备准备所述细胞外液用双蒸水的表。的pH值将是〜7.3后，10分钟曝气Carbogen增（95％O 2/5％CO 2），300毫渗8的渗透压。如果需要更高的渗透压是必需的，它可以进行调整，通过添加更多的葡萄糖（1mM的等于1毫渗）。该溶液被过滤两次，使用0.2μm的膜过滤器，以消除灰尘颗粒和可能的细菌污染。 试剂名称</stro…
Discussion
在神经科学中的一个主要问题是了解大脑是如何处理社会信息化。一个主要的编码嗅觉或信息素信号源所需的信息社会的认可。这些信号在鼻子和识别的信号在大脑中，尤其是下丘脑的神经元群体的检测，发挥了关键作用，许多社会进程和影响的激素和其他神经内分泌因子13-16。的一个重要障碍等脑区的神经元的反应，下丘脑多功能与多个神经元细胞核的分析是感兴趣的特定神经元的鉴定…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢我们的同事参加工作的总结。这项工作是支持的补助金从德意志研究联合会（SFB 894），的DFG Schwerpunktprogramm 1392“综合分析的嗅觉和德国大众汽车基金会（TLZ）。 TLZ是一个利希滕贝格教授，德国大众汽车基金会。
Materials
| Name | Company | Cat. N° |
| Agar | Sigma | A1296 |
| Fura-red/AM | Invitrogen | F-3021 |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 |
| Vibrating-Blade Microtome Hyrax V 50 | Zeiss | 9770170 |
| Cooling Device CU 65 for Microtome Hyrax V 50 | Zeiss | 9920120 |
| O2/CO2 Incubator, CB210-UL | Binder | 0019389 |
| Super glue, Loctite 406TM | Henckel | 142580 |
| Double spatulas, spoon shape | Bochem | 3182 |
| Microspoon spatulas, spoon shape | Bochem | 3344 |
| Spring Scissors, Moria-Vannas-Wolff – 7mm Blades | Fine Science Tools | 15370-52 |
| Spring Scissors, Vannas – 3mm Blades | Fine Science Tools | 15000-00 |
| Wagner Scissors | Fine Science Tools | 14071-12 |
| Medical Forceps, Dumont 7b | Fine Science Tools | 11270-20 |
| Large Rectangular Open Bath Chamber (RC-27) | Warner Instruments | 64-0238 |
| Confocal Microscope BioRad Radiance 2100 | Zeiss | n.a. |
References
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Tags
ImagingCalcium ResponsesGFP-tagged NeuronsHypothalamic Mouse Brain SlicesEncoding Of InformationMolecular StepsNeurohormone Signal Transduction CascadesIntracellular Ca2+Synaptic SitesGreen Fluorescent Protein (GFP)Spatially And Temporally Stimulus-induced Ca2+ ResponsesNon-green Fluorescent Ca2+ Indicator DyeConfocal MicroscopyRatiometric Ca2+ Indicator Fura-2Ultraviolet (UV) Light
Citer Cet Article
Schauer, C., Leinders-Zufall, T. Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices. J. Vis. Exp. (66), e4213, doi:10.3791/4213 (2012).