Imaging Calcium respons i GFP-mærkede neuroner i hypothalamus musehjerne Slices
Summary
I denne protokol, opdatere vi de seneste fremskridt i billedbehandling Ca<sup> 2 +</sup> Signaler GFP-mærkede neuroner i hjernen vævsskiver ved hjælp af en rød fluorescerende Ca<sup> 2 +</sup> Indikatorfarvestof.
Abstract
Trods en enorm stigning i vores viden om mekanismerne bag kodning af information i hjernen, et centralt spørgsmål om de præcise molekylære trin samt aktiviteten af specifikke neuroner i multi-funktionelle kerner af områder i hjernen, såsom hypothalamus tilbage. Dette problem omfatter identifikation af de molekylære komponenter involveret i reguleringen af forskellige Neurohormonet signaltransduktionsbegivenheder kaskader. Stigninger i intracellulær Ca2 + spiller en vigtig rolle i reguleringen af følsomheden af neuroner, både på niveau med signaltransduktion og ved synaptiske steder.
Nye værktøjer er opstået for at hjælpe med at identificere neuroner i det utal af hjernens neuroner ved at udtrykke grønt fluorescerende protein (GFP) under kontrol af en bestemt promoter. At overvåge både rumligt og tidsligt stimulus-induceret Ca2 +-reaktionerne i GFP-mærkede neuroner, en ikke-grønt fluorescerende Ca2 + indikatorfarvestof needs der skal anvendes. Desuden er konfokal mikroskopi en foretrukken fremgangsmåde til billeddannelse individuelle neuroner i vævssnit på grund af sin evne til at visualisere neuroner i forskellige planer af dybden inde i vævet, og for at begrænse ud-af-fokus fluorescens. Den ratiometrisk Ca2 +-indikator fura-2 er blevet anvendt i kombination med GFP-mærkede neuroner 1. Imidlertid er farvestoffet exciteres af ultraviolet (UV) lys. Prisen for laseren og den begrænsede optiske indtrængningsdybde UV-lys hindret dets anvendelse i mange laboratorier. Endvidere kan GFP-fluorescens gribe ind i fura-2-signalerne 2. Derfor besluttede vi at bruge et rødt fluorescerende Ca2 +-indikatorfarvestof. Den enorme Strokes forskydning af fura-rød tillader flerfarvet analyse af rød fluorescens i kombination med GFP anvendelse af en enkelt excitationsbølgelængde. Vi havde tidligere gode resultater med fura-rød i kombination med GFP-mærkede olfaktoriske neuroner 3. Protokollerne for olfaktoriske vævssnit syntes at arbejde equally godt i hypothalamus neuroner 4. Fura-rød baseret Ca2 + billeddannelse blev også med held kombineret med GFP-mærkede pankreatiske β-celler og GFP-mærkede receptorer udtrykt i HEK-celler 5,6. En lille særhed af fura-rød er, at dens fluorescensintensitet ved 650 nm aftager, når indikatoren binder calcium 7. Derfor fluorescensen af hvilende neuroner med lavt Ca2 +-koncentrationen har relativt høj intensitet. Det skal bemærkes, at andre røde Ca 2 +-indikatorfarvestoffer eksisterer eller er under opbygning, vil der giver bedre eller forbedrede resultater i forskellige neuroner og områder i hjernen.
Protocol
Discussion
Et vigtigt spørgsmål i neurovidenskab er at forstå, hvordan hjernen bearbejder social information. En fremherskende kilde til nødvendige oplysninger til social anerkendelse er kodet af olfaktoriske eller pheromonal signaler. Påvisningen af disse signaler ved neuronale populationer i næsen og anerkendelse af de signaler i hjernen, især hypothalamus, spiller en central rolle i mange sociale processer og indflydelse hormoner og andre neuroendokrine faktorer 13-16. En væsentlig hindring for at analysere n…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker vores kolleger, der har deltaget i arbejdet opsummeret her. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 894), DFG Schwerpunktprogramm 1392 'Integrativ analyse af lugtesansen «og ved Volkswagen Foundation (TLZ). TLZ er en Lichtenberg professor i Volkswagen Foundation.
Materials
| Name | Company | Cat. N° |
| Agar | Sigma | A1296 |
| Fura-red/AM | Invitrogen | F-3021 |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 |
| Vibrating-Blade Microtome Hyrax V 50 | Zeiss | 9770170 |
| Cooling Device CU 65 for Microtome Hyrax V 50 | Zeiss | 9920120 |
| O2/CO2 Incubator, CB210-UL | Binder | 0019389 |
| Super glue, Loctite 406TM | Henckel | 142580 |
| Double spatulas, spoon shape | Bochem | 3182 |
| Microspoon spatulas, spoon shape | Bochem | 3344 |
| Spring Scissors, Moria-Vannas-Wolff – 7mm Blades | Fine Science Tools | 15370-52 |
| Spring Scissors, Vannas – 3mm Blades | Fine Science Tools | 15000-00 |
| Wagner Scissors | Fine Science Tools | 14071-12 |
| Medical Forceps, Dumont 7b | Fine Science Tools | 11270-20 |
| Large Rectangular Open Bath Chamber (RC-27) | Warner Instruments | 64-0238 |
| Confocal Microscope BioRad Radiance 2100 | Zeiss | n.a. |
References
- Almholt, K., Arkhammar, P. O., Thastrup, O., Tullin, S. Simultaneous visualization of the translocation of protein kinase Calpha-green fluorescent protein hybrids and intracellular calcium concentrations. Biochem. J. 337 (Pt 2), 211-218 (1999).
- Bolsover, S., Ibrahim, O., O’Luanaigh, N., Williams, H., Cockcroft, S. Use of fluorescent Ca2+ dyes with green fluorescent protein and its variants: problems and solutions. Biochem. J. 356, 345-352 (2001).
- Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).
- Wen, S. Genetic identification of GnRH receptor neurons: a new model for studying neural circuits underlying reproductive physiology in the mouse brain. Endocrinology. 152, 1515-1526 (2011).
- Hara, M. Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, E1041-E1047 (2006).
- Doherty, A. J., Coutinho, V., Collingridge, G. L., Henley, J. M. Rapid internalization and surface expression of a functional, fluorescently tagged G-protein-coupled glutamate receptor. Biochem. J. 341 (Pt 2), 415-422 (1999).
- Kurebayashi, N., Harkins, A. B., Baylor, S. M. Use of fura red as an intracellular calcium indicator in frog skeletal muscle fibers. Biophys. J. 64, 1934-1960 (1993).
- Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. Gonadotropin-releasing hormone modifies action potential generation in sheep pars distalis gonadotropes. Neuroendocrinology. 58, 646-654 (1993).
- Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophys. J. 74, 1591-1599 (1998).
- Wen, S. Functional characterization of genetically labeled gonadotropes. Endocrinology. 149, 2701-2711 (2008).
- Paxinos, G., Franklin, J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From pheromones to behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
- Kelliher, K. R., Wersinger, S. R. Olfactory regulation of the sexual behavior and reproductive physiology of the laboratory mouse: effects and neural mechanisms. ILAR J. 50, 28-42 (2009).
- Yoon, H., Enquist, L. W., Dulac, C. Olfactory inputs to hypothalamic neurons controlling reproduction and fertility. Cell. 123, 669-682 (2005).
- Boehm, U., Zou, Z., Buck, L. B. Feedback loops link odor and pheromone signaling with reproduction. Cell. 123, 683-695 (2005).
- Wilson, J. M., Dombeck, D. A., Diaz-Rios, M., Harris-Warrick, R. M., Brownstone, R. M. Two-photon calcium imaging of network activity in XFP-expressing neurons in the mouse. J. Neurophysiol. 97, 3118-3125 (2007).
- Hu, J. Detection of near-atmospheric concentrations of CO2 by an olfactory subsystem in the mouse. Science. 317, 953-957 (2007).
- Perez, C. A. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. Nat. Neurosci. 5, 1169-1176 (2002).
- Trollinger, D. R., Cascio, W. E., Lemasters, J. J. Selective loading of Rhod 2 into mitochondria shows mitochondrial Ca2+ transients during the contractile cycle in adult rabbit cardiac myocytes. Biochem Biophys. Res. Commun. 236, 738-742 (1997).
- Meshik, X. A., Hyrc, K. L., Goldberg, M. P. Properties of Asante Calcium Red – a novel ratiometric indicator with long excitation wavelength. , (2010).
