Les réponses de calcium dans les neurones d'imagerie GFP-marqués de hypothalamiques tranches de cerveau de souris

Summary

Dans ce protocole, nous mettons à jour les progrès récents de l'imagerie Ca^{2 +} Signaux des neurones GFP-marqués dans les tranches de tissus du cerveau en utilisant un rouge fluorescent Ca^{2 +} Indicateur de colorant.

Abstract

Malgré une augmentation considérable de nos connaissances sur les mécanismes qui sous-tendent l'encodage de l'information dans le cerveau, une question centrale concernant les mesures précises moléculaires ainsi que l'activité des neurones spécifiques dans multi-fonctionnel des noyaux de zones du cerveau comme l'hypothalamus reste. Ce problème comprend l'identification des composants moléculaires impliqués dans la régulation des cascades de transduction du signal neurohormone différentes. Des élévations des intracellulaire de Ca ^{2 +} jouent un rôle important dans la régulation de la sensibilité des neurones, tant au niveau de la transduction du signal et sur ​​les sites synaptiques.

De nouveaux outils ont vu le jour pour aider à identifier les neurones dans la myriade de neurones du cerveau en exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) sous le contrôle d'un promoteur particulier. Pour surveiller à la fois spatialement et temporellement stimulus induit par Ca ^{2 +} dans les réponses des neurones marqués GFP, un non-fluorescente verte Ca ^{2 +} colorant indicateur needs à être utilisé. En outre, la microscopie confocale est une méthode préférée de neurones individuels d'imagerie dans des tranches de tissu en raison de sa capacité de visualiser des neurones dans des plans distincts de profondeur dans le tissu et pour limiter l'extérieur de la mise au point de fluorescence. La ratiométrique Ca ^{2 +} indicateur fura-2 a été utilisée en combinaison avec ^GFP-1 marqué neurones. Toutefois, le colorant est excité par le rayonnement ultraviolet (UV). Le coût du laser et de la profondeur de pénétration limitée optique de la lumière UV empêché son utilisation dans de nombreux laboratoires. En outre, fluorescence de la GFP peut interférer avec les signaux de ^fura-2 2. Par conséquent, nous avons décidé d'utiliser un rouge fluorescent Ca ^{2 +} colorant indicateur. L'énorme changement Strokes de fura-rouge permet une analyse de la fluorescence multicolore rouge en combinaison avec la GFP en utilisant une longueur d'onde d'excitation unique. Nous avons eu de bons résultats précédemment en utilisant le fura-rouge en combinaison avec GFP-étiqueté neurones olfactifs ^3. Les protocoles de tranches de tissus olfactifs semble fonctionner eQually bien dans les neurones hypothalamiques ^4. Fura-rouge à base de Ca ^{2 +} imagerie a également réussi à combiner avec pancréatiques GFP-β-cellules marqués et étiquetés GFP-récepteurs exprimés dans des cellules HEK ^5,6. Une petite bizarrerie de fura-rouge, c'est que son intensité de fluorescence à 650 nm diminue une fois l'indicateur fixe le calcium ^7. Par conséquent, la fluorescence des neurones au repos avec une faible concentration de Ca ^{2 +} a une intensité relativement élevée. Il est à noter, que les autres rouges Ca ^{2 +} indicateurs de colorants existent ou sont en cours d'élaboration, qui pourraient donner de meilleurs résultats ou améliorés dans les neurones du cerveau et de régions différentes.

Protocol

1. Préparation de la solution et gel d'agarose Préparer la solution extracellulaire selon le tableau avec de l'eau bidistillée. Le pH sera ~ 7,3 après 10 min d'aération avec carbogène (95% O 2/5% CO 2), l'osmolarité de 300 mOsm 8. Si une osmolarité supérieure est nécessaire, il peut être ajustée en ajoutant plus de glucose (1 mM est égal à 1 mOsm). La solution est filtrée deux fois en utilisant un filtre à membrane de 0,2 um pour éliminer les p…

Discussion

Une question majeure en neurosciences est de comprendre comment le cerveau traite l'information sociale. Une source prédominante de l'information nécessaire à la reconnaissance sociale est codé par des signaux olfactifs ou phéromones. La détection de ces signaux par des populations neuronales dans le nez et la reconnaissance des signaux dans le cerveau, en particulier l'hypothalamus, jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus sociaux et les hormones influencent et d'autres facteurs neuroe…

Materials

Name	Company	Cat. N°
Agar	Sigma	A1296
Fura-red/AM	Invitrogen	F-3021
Pluronic F-127	Sigma	P2443
Dimethyl sulfoxide	Fisher Scientific	BP231
Vibrating-Blade Microtome Hyrax V 50	Zeiss	9770170
Cooling Device CU 65 for Microtome Hyrax V 50	Zeiss	9920120
O2/CO2 Incubator, CB210-UL	Binder	0019389
Super glue, Loctite 406TM	Henckel	142580
Double spatulas, spoon shape	Bochem	3182
Microspoon spatulas, spoon shape	Bochem	3344
Spring Scissors, Moria-Vannas-Wolff – 7mm Blades	Fine Science Tools	15370-52
Spring Scissors, Vannas – 3mm Blades	Fine Science Tools	15000-00
Wagner Scissors	Fine Science Tools	14071-12
Medical Forceps, Dumont 7b	Fine Science Tools	11270-20
Large Rectangular Open Bath Chamber (RC-27)	Warner Instruments	64-0238
Confocal Microscope BioRad Radiance 2100	Zeiss	n.a.