Eine neuartige Methode der gerichteten Evolution spezifischen Bereich der Thermostabilität Engineering entwickelt wurde und folglich validiert bakteriolytischen Enzymen. Nach nur einem Runde der Zufallsmutagenese, ein weiterentwickelter bakteriolytischen Enzym, PlyC 29C3, erscheint größer als zweimal die Restaktivität bei dem Wildtyp-Protein nach erhöhter Temperatur Inkubation verglichen.
Gerichteten Evolution wird als eine Methode der natürlichen Selektion zu nutzen, um Proteine konstruieren, um besondere Eigenschaften, die nicht mit dem Protein in der Natur assoziiert sind zu erwerben definiert. Literatur hat zahlreiche Beispiele für die Umsetzung der gerichteten Evolution zur Verfügung gestellt, um erfolgreich zu verändern molekularen Spezifität und Katalyse 1. Der primäre Vorteil der Verwendung gerichteten Evolution statt rationellere Ansätze für Molekulartechnik betrifft das Volumen und Variantenvielfalt, die 2 gescreent werden können. Eine mögliche Anwendung der gerichteten Evolution beinhaltet die Verbesserung der strukturellen Stabilität bakteriolytischen Enzymen, wie Endolysinen. Bakteriophagen kodieren und auszudrücken Endolysine eine kritische kovalenten Bindung im Peptidoglycan (dh Zellwand) von Bakterien hydrolysieren, was Wirtszelle Lyse und Freisetzung von Nachkommen Virionen. Bemerkenswert ist, besitzen diese Enzyme die Fähigkeit, extrinsisch induziert Lyse susceptIVK Bakterien in Abwesenheit von Phagen und ferner wurden sowohl in vitro als auch in vivo für ihr therapeutisches Potential 3-5 validiert. Das Thema unserer gerichtete Evolution Studie beinhaltet die PlyC Endolysin, die aus PlyCA und PlyCB Untereinheiten 6 besteht. Wenn gereinigtes und fügte extrinsisch, lysiert die PlyC Holoenzym Gruppe A-Streptokokken (GAS) sowie anderen Streptokokken Gruppen in wenigen Sekunden und weiterhin wurde in vivo gegen GAS 7 validiert. Bezeichnenderweise Überwachung der Rest Enzymkinetik nach erhöhter Temperatur Inkubation bietet deutliche Hinweise darauf, dass PlyC lytische Aktivität verliert abrupt bei 45 ° C, was auf eine kurze therapeutische Haltbarkeit, die zusätzliche Entwicklung dieses Enzyms begrenzen kann. Weitere Studien zeigen, die mangelnde thermische Stabilität nur für die PlyCA Untereinheit beobachtet, während die PlyCB Untereinheit ist stabil bis zu ~ 90 ° C (unveröffentlichte Beobachtung). Neben PlyC bestehen siele Beispiele in der Literatur, die thermolabile Natur Endolysine beschreiben. Beispielsweise verliert die Staphylococcus aureus Endolysin LysK und Streptococcus pneumoniae Endolysinen Cpl-1 und Pal Aktivität spontan auf 42 ° C, 43,5 ° C und 50,2 ° C, jeweils 8-10. Nach der Arrhenius-Gleichung, die die Geschwindigkeit einer chemischen Reaktion bezieht sich auf die Temperatur, die in dem bestimmten System, wird eine Erhöhung der Thermostabilität mit einer Zunahme der Lebenserwartung Regal 11 korrelieren. Zu diesem Zweck hat die gerichtete Evolution gezeigt worden, um ein nützliches Werkzeug für die Änderung der thermischen Aktivität verschiedener Moleküle in der Natur, aber niemals hat dieser spezielle Technologie bereits erfolgreich für das Studium der bakteriolytischen Enzymen ausgenutzt. Ebenso erfolgreich Konten voran die strukturelle Stabilität von dieser besonderen Klasse von Antibiotika überhaupt sind nicht vorhanden. In diesem Video beschäftigen wir eine neue Methode, die einen Fehler-pr verwendetein DNA-Polymerase durch eine optimierte Siebvorgang unter Verwendung eines 96-Well-Mikrotiterplatten-Format, um Mutationen an den PlyCA Untereinheit des PlyC Streptokokken Endolysin die zu einer Erhöhung der Stabilität enzymkinetische (Abbildung 1) korrelieren identifizieren gefolgt. Ergebnisse nach nur einer Runde der Zufallsmutagenese schlagen die Methodik generiert PlyC Varianten, die mehr als zweimal die restliche Aktivität beibehalten, wenn zum Wildtyp (WT) PlyC nach erhöhter Temperatur Behandlung verglichen.
Dieses Protokoll, das in Abbildung 1 dargestellt, stellt eine 96-well Mikrotiterplatte Methodik, die ein bis gerichteten Evolution zu verwenden, um die Thermostabilität einer bakteriolytischen Enzyms erhöhen kann. Durch die Verwendung eines fehlerhaften DNA-Polymerase, einer zufälligen Mutationen, die die gesamte kinetische Stabilität des übersetzten bakteriolytischen Molekül von Interesse, das typischerweise durch molekularen Reorganisationen bestehend aus zunehmender elektrostatischen erhöhen einführen kann, Interaktionen Disulfidbrücke und hydrophoben erzeugen, die eine verbesserte Molekülpackung, erweiterte Modifikationen der Oberflächenladung Netzwerken oder Verstärkung einer höheren Oligomerisierungszustand 17-18. Nach dem Einbringen von Nukleotid-Mutationen wurde ein umfangreiches Screening-Verfahren dann verwendet, um Mutationen, die thermisch nutzbringende identifizieren. Die repräsentativen hier vorgestellten Ergebnisse wurden auf einer Runde Zufallsmutagenese basiert. In Wirklichkeit ist vorgeschlagen worden, dassmindestens drei aufeinanderfolgenden Runden der Zufallsmutagenese ist jede Verwendung der robustesten Mutante als Lead Enzym, gefolgt durch DNA-Shuffling geeignet für diese Art der gerichteten Evolution thermischen Verhaltens in der 2.
Es ist wichtig zu verstehen, dass, während diese Protokoll identifiziert Mutationen, die kinetische Stabilität zu vergrößern, diese Varianten nicht notwendigerweise Thermostabilität erhöht. Ein Molekül wird als thermostabile wenn es die Fähigkeit, seine Struktur auf einer hohen Temperatur zu halten hat. Jedoch in dem Assay präsentiert werden die Restaktivität der Mutante Lysaten nicht bei gleicher Temperatur, dass sie zunächst wurden während des Wärmebehandlungsschritts inkubiert und damit ein möglicherweise für Mutationen, die Rückfaltung anstatt verbesserte Thermostabilität 19 fördern Auswählen getestet. Während wir Extrapolieren thermische Verhalten als Hinweis auf thermische Stabilität muss wahre thermische Stabilität empirisch durch Biophys messendenical Methoden wie Circulardichroismus (CD), Differential Scanning Calorimetry (DSC) und Differential-Scanning-Fluorimetrie (DSF). Vorläufige Daten von CD und DSF Experimenten legen nahe, dass mehrere Kandidaten von der Methode vorgestellt identifiziert tatsächlich anzuzeigen fortgeschritten Thermostabilität (Daten nicht gezeigt).
Obwohl der hier vorgestellte Methode ist spezifisch für Anwendung erhöhten thermischen Verhalten PlyC kann diese gleiche Methode verwendet werden, um zusätzlich thermische Aktivität auf andere bakteriolytischen Enzymen steigern mit geringfügigen Veränderungen Variablen wie Puffer, Mutationsraten, Erwärmungsbedingungen und Expressionssysteme werden. Eine kritische Variable assoziiert mit diesem Assay betrifft die Nukleotid Mutationsrate des fehlerhaften DNA-Polymerase. Wir entschieden uns für die fehleranfällige Mutazyme II-DNA-Polymerase in unserem gerichtete Evolution Assay verwenden, durch experimentelle Hinweise darauf, diese besondere Enzym zeigt die geringste Vorspannung mitBezug auf die Nukleotide werden zufällig in dem interessierenden Gen eingebaut, wenn auf andere zufällige Mutagenese-Techniken, wie die Verwendung von Hydroxylamin, Mutator E. Vergleich coli-Stämme und andere fehleranfällige DNA polyermases 20. Im Allgemeinen neigen niedrigere Mutationsraten zu sein aus zwei Gründen wünschenswert. Erstens Engineering Thermostabilität an Proteine typischerweise aus relativ wenigen Aminosäuresubstitutionen. Hohe Mutationsraten kann dramatische strukturelle Veränderungen insbesondere Moleküle, die abschließend in strukturellen Fehlfaltung und funktionelle Abweichungen führen kann. Beispielsweise kann die Einarbeitung von Glycin und Prolin-Reste stören alpha schraubenförmigen sekundären Strukturen 21. Sekunde, hohe Nukleotid Mutationsraten die Chancen erhöhen Einbeziehung vorzeitige Stoppcodons, was abgeschnitten Moleküle, die biologisch inaktiv sind. Im Allgemeinen werden niedrigere Mutationsraten bevorzugt, da geringere Fehlerraten Ergebnis im accumulation der adaptiven Mutationen während höhere Mutationsraten neutral oder schädlichen Mutationen zu erzeugen 22.
Für jede Runde der Zufallsmutagenese, beinhaltet eine weitere kritische Variable, daß man Optimierung des Inkubationstemperatur während des Screening-Prozesses verwendet wird. Auswahl der experimentellen nicht-permissiven Temperatur ist relativ schwierig. Wir haben uns zunächst verwendet eine Inkubationstemperatur, die 10 ° C höher als die nicht-permissiven Temperatur von PlyC, aber nach Screening 3.000 Mutanten konnten wir keine vorteilhafte Mutationen zu identifizieren. Unter Berücksichtigung der gerichteten Evolution Methoden aus sequenziellen Identifizieren von Vorteil Aminosäuresubstitutionen, additive Wirkungen haben, wurde festgestellt, dass eine weniger strenge Temperatur während des Screening-Prozesses verwendet werden soll, auch wenn es die Möglichkeit der Erzeugung Fehlalarmen erhöht. Als solches verwendet man eine Inkubationstemperatur betrug die nur wenige Grad oberhalb der Nicht-Zulive Temperatur und nachgesiebt ausgewählten Bewerber auszuschließen, die False-Positives.
Wir entschieden uns, eine Inkubationstemperatur, die nicht allzu gemäßigten nutzen (≤ 1 ° C höher als niedrigsten nicht-permissiven Temperatur) und umgekehrt nicht zu hart (≥ 5 ° C höher als niedrigsten nicht-permissiven Temperatur). Die ideale Temperatur haben wir beschlossen, in diesem speziellen Assay verwenden, war eine moderate 2 ° C höher als die experimentell ermittelten nicht-permissiven Temperatur. Auswählen einer Temperatur, die zu mild ist, wird in einer wesentlich höheren falsch positiven Identifizierung Rate als die ~ 20% haben wir beobachtet (Tabelle I) ergeben bei Verwendung eines moderaten Inkubationstemperatur. Darüber hinaus konnte mit einer Inkubationstemperatur, die zu hart ist letztlich in der Unfähigkeit, Mutanten mit deutlich verbesserte thermische Verhalten zu identifizieren führen. Zum Beispiel mit einer Inkubationstemperatur von ≥ 5 ° C würde in der Unfähigkeit geführt haben, um die Identifizierungverspricht 29C3 Mutante als auch die Mehrheit der anderen Kandidaten in der ersten Screening-Runde ausgewählt.
In Summe bieten wir ein Protokoll für Engineering bakteriolytischen Enzyme verbesserte kinetische Stabilität zu erwerben. Darüber hinaus kann diese gleichen Assay ohne die Erwärmungsschritte, zum Screening auf Mutationen, die katalytische Aktivität zu erhöhen verwendet werden. Vermehrung sowohl katalytische Aktivität und Thermostabilität ist ein wichtiger Entwicklungs-Hürde keinen therapeutischen Enzym. Obwohl die Details dieser protokollspezifischen zum Endolysin PlyC sind, kann die Methodik einem bakteriolytischen Enzym mit nur wenigen Änderungen angepasst werden. Wir die vorläufigen Ergebnisse aus nur der ersten Runde der Mutagenese, die diese Funktionalität des Assay überprüft, was zur Umsetzung und zur Identifizierung von Mutationen, die eine Erhöhung der Thermostabilität von molekularen signifikanter Größe generieren.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren möchten sich Emilija Renke und Janet Yu für die technische Unterstützung bedanken. DCN ist durch Zuschüsse aus dem United States Department of Defense (DR080205, DM102823, OR09055 und OR090059) unterstützt. RDH wird durch einen Zuschuss aus dem Maryland Landwirtschaft Experiment Station und einer NIH Training Grant in Cell and Molecular Biology unterstützt.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
B-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78260 |
GeneMorph II Random Mutagenesis Kit | Agilent Technologies | 200500 |
Clear 96 Well, Flat-bottomed Microtiter Plate With Lid | BD Vacutainer Labware Medical | 353072 |
96 Well Nonskirted PCR Plates | Fisher Scientific | 14-230-232 |
Swing-bucket Rotor | Eppendorf | A-2-DWP |
Ampicillin Sodium Salt | Fisher Scientific | BP1760 |
Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904 |
Arabinose | Fisher Scientific | BP2504 |
pBAD24 Expression Vector | ATCC | 87399 |
pBAD33 Expression Vector | ATCC | 87402 |