En roman rettet evolusjon metode spesifikk til feltet av thermostability engineering ble utviklet og følgelig validert for bacteriolytic enzymer. Etter bare en runde av tilfeldig mutagenese, en utviklet bacteriolytic enzym, PlyC 29C3, vises større enn to ganger restaktivitet når sammenlignet med villtype-protein etter forhøyet temperatur inkubasjon.
Rettet evolusjon er definert som en metode for å utnytte naturlig seleksjon for å konstruere proteiner å erverve bestemte egenskaper som ikke er forbundet med proteinet i naturen. Litteratur har gitt mange eksempler om gjennomføringen av rettet evolusjon for å kunne endre molekylær spesifisitet og katalyse en. Den primære fordelen med å benytte rettet evolusjon i stedet for mer rasjonell tilnærminger for molekylær teknikk knyttet til volum og mangfold av varianter som kan bli vist to. En mulig anvendelse av rettet evolusjon innebærer bedre strukturell stabilitet av bacteriolytic enzymene, som endolysins. Bakteriofag kode og uttrykke endolysins å hydrolysere en kritisk kovalent binding i peptidoglykan (dvs. celleveggen) av bakterier, noe som resulterer i host cellelyse og frigjøring av avkom virioner. Spesielt, disse enzymene har evnen til extrinsically indusere lysis å susceptvertible bakterier i fravær av phage og dessuten har blitt validert både de vitro og in vivo for deres terapeutiske potensial 3-5. Gjenstand for vår rettet evolusjon studie involverer PlyC endolysin, som er sammensatt av PlyCA og PlyCB subenheter 6. Når renset og lagt extrinsically, lyserer PlyC holoenzyme gruppe A streptokokker (GAS) samt andre streptokokker grupper i løpet av sekunder og videre har blitt validert in vivo mot GAS 7. Betydelig, overvåking restoljen enzymkinetikk etter forhøyet temperatur inkubering gir distinkte bevis for at PlyC mister lytisk aktivitet brått ved 45 ° C, noe som tyder på en kort terapeutisk holdbarhet, noe som kan begrense ytterligere utvikling av dette enzymet. Videre studier avdekke mangel på termisk stabilitet er kun observert for PlyCA subenheten, mens PlyCB subenheten er stabil opp til ~ 90 ° C (upublisert observasjon). I tillegg til PlyC, Det er several eksempler i litteraturen som beskriver termolabile natur endolysins. For eksempel, den Staphylococcus aureus endolysin LysK og Streptococcus pneumoniae endolysins Cpl-1 og Pal miste aktiviteten spontant ved 42 ° C, 43,5 ° C og 50,2 ° C, henholdsvis 8-10. Ifølge Arrhenius ligningen, som vedrører hastigheten til en kjemisk reaksjon på temperaturen til stede i enkelte system, vil en økning i thermostability korrelerer med en økning i sokkel levealder 11. Mot denne enden, har rettet evolusjon blitt vist å være et nyttig hjelpemiddel for å endre den termiske aktivitet av forskjellige molekyler i naturen, men har aldri dette bestemt teknologi blitt utnyttes for studiet av bacteriolytic enzymer. Likeledes vellykkede beretninger framdrift strukturell stabilitet av denne spesielle klasse av antimikrobielle midler helt er ikke-eksisterende. I denne videoen, ansetter vi en ny metode som bruker en feil pren DNA polymerase etterfulgt av en optimalisert screening ved bruk av en 96 brønn mikrotiterplate format å identifisere mutasjoner til PlyCA subenhet av PlyC streptokokk endolysin som korrelerer til en økning i enzym kinetiske stabiliteten (figur 1). Resultater etter bare én runde med tilfeldig mutagenese foreslår metodikken genererer PlyC varianter som beholder mer enn det dobbelte av gjenværende aktivitet sammenlignet med villtype (WT) PlyC etter forhøyet temperatur behandling.
Denne protokollen, skissert i figur 1, viser en 96 brønn mikrotiterplate metodikk som tillater en å utnytte rettet evolusjon å øke thermostability av enhver bacteriolytic enzym. Gjennom bruk av en feilutsatt DNA polymerase, en introdusere tilfeldige mutasjoner som øker den samlede kinetiske stabiliteten av det oversatte bacteriolytic molekyl av interesse, noe som er typisk skyldes molekylære omorganiseringer bestående av økende elektrostatisk, disulfidbro og hydrofobe interaksjoner som genererer forbedret molekylær pakking, forbedrede modifikasjoner av overflaten ansvaret nettverk eller forsterkning av en høyere oligomerisering tilstand 17-18. Etter innføringen av nukleotid mutasjoner, ble en omfattende screeningsprosedyre deretter brukes til å identifisere mutasjoner som er termisk gunstig. De representative resultater som presenteres her er basert på en runde med tilfeldig mutagenese. I realiteten er det blitt foreslått atminst tre suksessive runder av tilfeldig mutagenese, er hver ved hjelp av mest robuste mutanten som ledende enzymet, etterfulgt av DNA-shuffling hensiktsmessig for disse typer rettet evolusjon termisk oppførsel studier 2.
Det er viktig å forstå at mens denne protokollen identifiserer mutasjoner som utvider kinetisk stabilitet, disse variantene ikke nødvendigvis har økt thermostability. Et molekyl anses termostabilt når det har evnen til å beholde sin struktur ved en høy temperatur. Imidlertid, i analysen presentert, blir den gjenværende aktivitet av de mutante lysater ikke analysert ved den samme temperatur som de opprinnelig ble inkubert ved under varmebehandlingen trinn og dermed en kan velge for mutasjoner som fremmer refolding fremfor forbedret thermostability 19. Mens vi ekstrapolere termisk oppførsel som en indikasjon på termisk stabilitet, må sann termisk stabilitet måles empirisk ved Biophysical metoder som sirkulær dichroism (CD), Differential Scanning Calorimetry (DSC) og differensial skanning fluorimetry (DSF). Foreløpige data fra CD-og DSF eksperimenter tyder på at flere kandidater identifisert fra metodikken presentert gjør faktisk vise kommet thermostability (data ikke vist).
Selv om metodikken som presenteres her er spesifikk for gjennomføring økt termisk oppførsel til PlyC, kan dette samme metode i tillegg brukes til å forbedre termisk aktivitet til andre bacteriolytic enzymer med noen mindre endringer i variabler som buffere, mutasjon priser, oppvarming betingelser og uttrykk systemer. Et kritisk variabel assosiert med denne analysen vedrører nukleotid mutasjon rate av feilutsatt DNA polymerase. Vi valgte å bruke utsatt for feil Mutazyme II DNA polymerase i vår rettet evolusjon analysen på grunn eksperimentelle bevis som tyder på dette spesielt enzym viser minst skjevhet medhensyn til hvilke nukleotider er tilfeldig innlemmet i genet av interesse i forhold til andre tilfeldige mutagenese teknikker så som bruk av hydroksylamin, mutator E. coli stammer og andre utsatt for feil DNA polyermases 20. Generelt lavere mutasjon priser tendens til å være mer ønskelig av to grunner. Først, består prosjektering thermostability til proteiner vanligvis av relativt få aminosyresubstitusjoner. Høye mutasjon priser kan føre til dramatiske strukturelle endringer til bestemte molekyler som kan endelig resultere i strukturelle misfolding og funksjonelle avvik. For eksempel kan inkorporering av glycin og prolin rester forstyrre alfa skrueformede sekundære strukturer 21. Sekund, High nukleotid mutasjon priser øker sjansene for å innlemme tidlig stopp kodon, som resulterer i avkortede molekyler som er biologisk inaktive. Generelt er lavere mutasjon priser foretrekkes fordi lavere feilrater resultat i accumulasjon av adaptive mutasjoner mens høyere mutasjon priser generere nøytrale eller skadelig mutasjoner 22.
For hver runde av tilfeldig mutagenese, innebærer en annen kritisk variabel at man må optimalisere inkubasjonstemperatur brukt under screening prosessen. Valg av den eksperimentelle ikke-permissive temperaturen er relativt utfordrende. Vi opprinnelig brukt en inkubasjonstemperatur som var 10 ° C høyere enn den ikke-ettergivende temperatur på PlyC, men etter screening 3000 mutanter, var vi i stand til å identifisere eventuelle fordelaktige mutasjoner. Husk rettet evolusjon metoder består av sekvensielt identifisere gunstige aminosyresubstitusjoner som har additive effekter, ble det fastslått at et mindre strengt temperatur skal brukes i løpet av screening prosessen, selv om den økte sjansen for å generere falske-positive. Som sådan, vi brukte en inkubasjonstemperatur som var bare noen få grader over den ikke-permissive temperatur og rescreened utvalgte kandidater til å utelukke de falske positiver.
Vi besluttet å bruke en inkubasjonstemperatur som ikke var altfor temperert (≤ 1 ° C høyere enn laveste non-permissive temperatur) og omvendt ikke altfor harde (≥ 5 ° C høyere enn laveste non-permissive temperatur). Den ideelle temperaturen vi besluttet å bruke i denne analysen var en moderat 2 ° C høyere enn den eksperimentelt bestemte ikke-ettergivende temperatur. Velge en temperatur som er for mild, vil resultere i en mye høyere falsk positiv identifikasjon enn den ~ 20% vi observert (tabell I) ved bruk av en moderat inkubasjonstemperatur. Videre kunne bruke en inkubasjonstemperatur som er for harde til slutt resultere i manglende evne til å identifisere mutanter med betydelig forbedret termisk oppførsel. For eksempel, ved hjelp av en inkubasjonstemperatur på ≥ 5 ° C ville ha resultert i manglende evne til å identifiserelovende 29C3 mutant samt de fleste av de andre kandidatene som ble valgt i den første runden av screening.
I summering, tilbyr vi en protokoll for prosjektering bacteriolytic enzymer for å skaffe økt kinetisk stabilitet. Dessuten kan dette samme assay, uten varmetrinn, brukes til å screene for mutasjoner som øker katalytisk aktivitet. Forsterke både katalytisk aktivitet og thermostability er ein viktig utviklingsmessig hinder overfor noen terapeutisk enzymet. Mens detaljene i denne protokollen er spesifikke for endolysin PlyC kan metodikken tilpasses enhver bacteriolytic enzym med bare noen få endringer. Vi presenterte foreløpige resultater fra bare den første runden av mutagenese som validerer at funksjonaliteten av analysen, noe som resulterer i gjennomføringen og identifisering av mutasjoner som genererer en økning i molekylær thermostability av betydelig omfang.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Emilija Renke og Janet Yu for teknisk assistanse. DCN er støttet med tilskudd fra United States Department of Defense (DR080205, DM102823, OR09055, og OR090059). RDH er støttet av et stipend fra Maryland Landbruk Experiment Station og en NIH Training Grant i celle-og molekylærbiologi.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
B-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78260 |
GeneMorph II Random Mutagenesis Kit | Agilent Technologies | 200500 |
Clear 96 Well, Flat-bottomed Microtiter Plate With Lid | BD Vacutainer Labware Medical | 353072 |
96 Well Nonskirted PCR Plates | Fisher Scientific | 14-230-232 |
Swing-bucket Rotor | Eppendorf | A-2-DWP |
Ampicillin Sodium Salt | Fisher Scientific | BP1760 |
Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904 |
Arabinose | Fisher Scientific | BP2504 |
pBAD24 Expression Vector | ATCC | 87399 |
pBAD33 Expression Vector | ATCC | 87402 |