Ett nytt riktad evolution som är specifik för det område av termostabilitet teknik utvecklades och följaktligen validerade för bakteriolytiskt enzym. Efter endast en omgång av slumpmässig mutagenes, en utvecklad bakteriolytiskt enzym, PlyC 29C3, visade större än två gånger den kvarvarande aktivitet jämfört med vildtypsproteinet efter förhöjd temperatur inkubation.
Riktad evolution definieras som en metod för att utnyttja det naturliga urvalet för att manipulera proteiner att förvärva särskilda egenskaper som inte är associerade med proteinet i naturen. Litteratur har gett många exempel när det gäller genomförandet av riktad evolution att framgångsrikt förändra molekylär specificitet och katalys 1. Den främsta fördelen med att använda riktad evolution i stället för mer rationell baserade metoder för molekylär teknik avser volym och mångfald av varianter som kan screenas 2. En möjlig tillämpning av riktad evolution handlar om att förbättra den strukturella stabiliteten hos bakteriolytiskt enzymer, såsom endolysins. Bakteriofag koda och uttrycka endolysins att hydrolysera en kritisk kovalent bindning i peptidoglykan (dvs. cellvägg) av bakterier, vilket resulterar i värdcellens lys och frigörelse av avkomma virioner. Noterbart dessa enzymer har förmågan att extrinsically inducera lys att susceptsg bakterier i frånvaro av fag och dessutom har validerats både in vitro och in vivo för deras terapeutiska potential 3-5. Ämnet för vår riktad evolution studie innebär PlyC endolysin, som består av PlyCA och PlyCB subenheter 6. När renas och lagt extrinsically, lyserar den PlyC holoenzym grupp A-streptokocker (GAS) samt andra streptokocker grupp på några sekunder och dessutom har validerats in vivo mot GAS 7. Betecknande övervakning kvarvarande enzymkinetik efter förhöjd temperatur inkubation ger distinkt bevis på att PlyC förlorar lytisk aktivitet abrupt vid 45 ° C, vilket tyder på en kort terapeutisk hållbarhetstid, vilket kan begränsa ytterligare utveckling av detta enzym. Ytterligare studier avslöjar bristen på termisk stabilitet endast observeras för PlyCA subenheten, medan PlyCB subenheten är stabil upp till ~ 90 ° C (opublicerad observation). Förutom PlyC finns finnseveral exempel i litteraturen som beskriver termolabila natur endolysins. Till exempel Staphylococcus aureus endolysin LysK och Streptococcus pneumoniae endolysins Cpl-1 och Pal förlorar aktivitet spontant vid 42 ° C, 43,5 ° C och 50,2 ° C respektive 8-10. Enligt Arrhenius ekvation, som beskriver sambandet mellan hastigheten för en kemisk reaktion på temperaturen som finns i det speciella systemet, kommer en ökning i termostabilitet korrelerar med en ökning i hållbarhetstiden förväntad 11. För detta ändamål har riktad evolution visat sig vara ett användbart verktyg för att förändra den termiska aktiviteten hos olika molekyler i naturen, men aldrig har denna teknik utnyttjats framgångsrikt för att studera bakteriolytiskt enzymer. Likaså framgångsrika konton framåt den strukturella stabiliteten hos denna klass av antimikrobiella medel är helt obefintlig. I den här videon, använder vi en ny metod som använder en fel-prett DNA-polymeras följt av en optimerad screening process med användning av en 96 brunnsformat mikrotiterplatta för att identifiera mutationer i PlyCA underenheten av PlyC streptokocker endolysin som korrelerar med en ökning av enzym kinetisk stabilitet (figur 1). Resultat efter bara en omgång med slumpmutagenes föreslår metoden genererar PlyC varianter som bibehåller mer än dubbelt kvarvarande aktivitet jämfört med vild-typ (WT) PlyC efter förhöjd temperatur behandling.
Detta protokoll, som beskrivs i figur 1, presenterar en 96 väl metodik mikrotiterplatta som gör att man kan utnyttja riktad evolution för att öka värmestabiliteten hos ett bakteriolytiskt enzym. Genom användning av ett felbenägen DNA-polymeras, kan man införa slumpmässiga mutationer som ökar den totala kinetiska stabiliteten av den translaterade bakteriolytiskt molekylen av intresse, vilket är typiskt beror på molekylära omorganisationer bestående av ökande elektrostatisk, disulfidbrygga och hydrofoba interaktioner som genererar förbättrad molekylär packning, förbättrade modifieringar av nätverk yta avgift eller förstärkning av ett högre oligomerisering tillstånd 17-18. Efter införandet av nukleotidmutationer gjordes en omfattande screening förfarande används sedan för att identifiera mutationer som är termiskt fördelaktigt. De representativa resultat presenteras här var baserade på en omgång av slumpmässig mutagenes. I verkligheten har det föreslagits attminst tre på varandra följande rundor av slumpmässig mutagenes, är varje med den mest robusta mutanten som den ledande enzymet, följt av DNA-skyffling lämplig för dessa typer av riktad evolution termiska beteende studier 2.
Det är viktigt att förstå att även detta protokoll identifierar mutationer som utökar kinetisk stabilitet, inte dessa varianter inte nödvändigtvis ökat termostabilitet. En molekyl anses termostabil när den har förmågan att bibehålla sin struktur vid en hög temperatur. I den presenterade analysen, är den kvarvarande aktiviteten av de mutanta lysaten analyserades inte vid samma temperatur som de initialt inkuberades vid under värmebehandlingssteget och därmed en kan selektera för mutationer som främjar återveckning snarare än förbättrad termostabilitet 19. Medan vi extrapolera termiskt beteende som en indikation på termisk stabilitet, måste sanna termisk stabilitet mätas empiriskt genom Biophyska metoder såsom cirkulär dikroism (CD), differentiell svepkalorimetri (DSC) och differentialavsökande fluorimetri (DSF). Preliminära data från CD-och DSF experiment tyder på att flera kandidater identifierats från den presenterade metoden verkligen inte visa fortskred termostabilitet (data visas inte).
Även den metod som presenteras här är specifik för genomförandet ökad termisk beteende PlyC kan samma metodik dessutom användas för att förbättra termisk aktivitet till andra bakteriolytiskt enzymer med några smärre ändringar variabler såsom buffertar, priser mutation, villkor värme-och uttryck. En kritisk variabel associerad med denna analys avser nukleotid mutationshastighet av felbenägna DNA-polymeras. Vi valde att använda felbenägen Mutazyme II DNA-polymeras i vår riktad evolution analys på grund av experimentella bevis tyder detta enzym visar minsta partiskhet medgäller vilka nukleotider är slumpvis införlivas genen av intresse jämfört med andra slumpmässiga mutagenestekniker, såsom användning av hydroxylamin, mutator E. coli-stammar och andra felbenägen DNA polyermases 20. I allmänhet, lägre mutation tenderar att vara mer önskvärt av två skäl. Först består teknisk termostabilitet till proteiner typiskt relativt få aminosyrasubstitutioner. Höga mutation priser kan orsaka dramatiska strukturella förändringar till vissa molekyler som slutgiltigt kan leda strukturell felveckning och funktionella avvikelser. Till exempel, kan inkorporeringen av glycin och prolinrester störa alfa spiralformade sekundära strukturer 21. Det andra, höga nukleotid mutation skulle öka chanserna att införliva prematura stoppkodon, vilket resulterar i trunkerade molekyler som är biologiskt inaktiva. I allmänhet lägre priser mutation föredrages eftersom lägre felprocent resulterar i accumulring av adaptiva mutationer medan högre mutation priser genererar neutrala eller skadliga mutationer 22.
För varje omgång av slumpmässig mutagenes, innebär en annan kritisk variabel som man måste optimera inkubationstemperaturen används under screeningsprocessen. Val av den experimentella icke-permissiv temperatur är relativt utmanande. Vi användes ursprungligen en inkubationstemperatur som var 10 ° C högre än den icke-tillåtande temperatur PlyC, men efter screening 3.000 mutanter, kunde vi inte hitta några fördelaktiga mutationer. Med tanke på riktad evolution metoder består av sekventiellt identifiera nyttiga aminosyrasubstitutioner som har additiva effekter bestämdes det att en mindre sträng temperatur bör användas under screening process, även om den ökade risken för att generera falskt positiva. Som sådan har vi använt en inkubationstemperatur som var bara några grader över den icke-permissive temperatur och återscreenades utvalda kandidater att utesluta falskt positiva.
Vi bestämde oss för att använda en inkubationstemperatur som inte var alltför tempererat (≤ 1 ° C högre än lägsta icke tillåtna temperaturen) och omvänt inte för hårt (≥ 5 ° C högre än lägsta icke tillåtna temperaturen). Den idealiska temperaturen beslutade vi att använda i denna analys var en måttlig 2 ° C högre än den experimentellt bestämda icke-permissiv temperatur. Välja en temperatur som är alltför lätt kommer att resultera i en mycket högre falskt positiv identifiering takt än ~ 20% vi observerade (tabell I) vid användning av en måttlig inkubationstemperatur. Dessutom kan användning av en inkubationstemperatur som är alltför hård slutligen resulterar i oförmåga att identifiera mutanter med väsentligt förbättrad termisk beteende. Till exempel, med användning av en inkubationstemperatur av ≥ 5 ° C skulle ha resulterat i oförmågan att identifieralovande 29C3 mutant samt majoriteten av de andra kandidaterna som valts under den första rundan av screening.
I summering ger vi ett protokoll för teknik bakteriolytiskt enzymer för att förvärva ökad kinetisk stabilitet. Dessutom kan denna samma analys, utan uppvärmningssteg, användas för att screena för mutationer som ökar katalytisk aktivitet. Utöka både katalytisk aktivitet och termostabilitet är en viktig utvecklings hindret någon terapeutisk enzym. Medan detaljerna i detta protokoll är specifika för endolysin PlyC kan metoden anpassas till varje bakteriolytiskt enzym med endast ett fåtal ändringar. Vi presenterade preliminära resultat från endast den första omgången av mutagenes som validerar att funktionaliteten av analysen, vilket resulterar i genomförandet och identifiering av mutationer som genererar en ökning i molekylär termostabilitet av betydande storlek.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Emilija Renke och Janet Yu för tekniskt stöd. DCN stöds av bidrag från USA: s försvarsdepartement (DR080205, DM102823, OR09055 och OR090059). RDH stöds av ett bidrag från Maryland Jordbruk Experiment Station och en NIH Training Grant i cell-och molekylärbiologi.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
B-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78260 |
GeneMorph II Random Mutagenesis Kit | Agilent Technologies | 200500 |
Clear 96 Well, Flat-bottomed Microtiter Plate With Lid | BD Vacutainer Labware Medical | 353072 |
96 Well Nonskirted PCR Plates | Fisher Scientific | 14-230-232 |
Swing-bucket Rotor | Eppendorf | A-2-DWP |
Ampicillin Sodium Salt | Fisher Scientific | BP1760 |
Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904 |
Arabinose | Fisher Scientific | BP2504 |
pBAD24 Expression Vector | ATCC | 87399 |
pBAD33 Expression Vector | ATCC | 87402 |