Un protocole simple de préparation d'extraits de tissus humains pour être utilisées comme source d'antigènes à des cellules T fonctionnelles des essais est décrit. Cette méthode permet réponses des cellules T à des antigènes dérivés de tissus à mesurer In vitro.
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Article de méthode
Extraction des antigènes tissulaires de tests fonctionnels
Dans cet article
Résumé
Résumé
La plupart des antigènes cibles de la réponse immunitaire adaptative, reconnus par les cellules B et T, n'ont pas été définis 1. Cela est particulièrement vrai dans les maladies auto-immunes et le cancer 2. Notre objectif est d'étudier les antigènes reconnus par les lymphocytes T humains dans le type 1, diabète maladie auto-immune 1,3,4,5. Pour analyser des cellules T humaines réponses contre les tissus où les antigènes reconnus par les lymphocytes T ne sont pas identifiés, nous avons développé une méthode pour extraire les antigènes protéiques de tissus humains dans un format qui est compatible avec les analyses fonctionnelles 6. Réponses précédemment, des cellules T à des extraits de tissus non purifiés n'a pas pu être mesurée, car les méthodes d'extraction donner un lysat contenant des détergents qui étaient toxiques pour les cellules mononucléées du sang périphérique. Ici, nous décrivons un protocole d'extraction de protéines à partir de tissus humains dans un format qui n'est pas toxique pour les cellules T humaines. Le tissu est homogénéisé dans un mélange de butan-1-ol, l'acétonitrile et water (BAW). La concentration en protéines dans l'extrait de tissu est mesurée et une masse connue de protéine est mise dans des tubes. Après extraction, les solvants organiques sont éliminés par lyophilisation. Extraits de tissus lyophilisés peuvent être conservés jusqu'à leur utilisation. Pour une utilisation dans des tests de la fonction immunitaire, une suspension de cellules du système immunitaire, dans les milieux de culture appropriés, peuvent être ajoutés directement à l'extrait lyophilisé. La production de cytokines et la prolifération des PBMC par, en réponse à des extraits préparés en utilisant cette méthode, ont été faciles à mesurer. Par conséquent, notre méthode permet la préparation rapide des lysats de tissus humains qui peuvent être utilisés comme source d'antigènes dans l'analyse des réponses des cellules T. Nous suggérons que cette méthode va faciliter l'analyse des réponses immunitaires adaptatives des tissus de greffe, le cancer et l'auto-immunité.
Protocole
1. Préparation de tissu de la rate
- Remarque-tout le matériel humain doit être traité comme potentiellement infectieux et toutes les procédures doivent être menées dans un cabinet à flux laminaire de classe II. Avec des ciseaux et des pinces stériles, retirer les tissus adipeux et fibreux issus de sections rate (~ 1-2 cm) et coupez autant de matériel que possible capsule externe.
- Coupez un petit morceau (1-2 cm 3) de tissu de la rate et placer chaque morceau dans un tube stérile Falcon de 50 ml.
- Snap-congeler les morceaux de tissu par immersion dans l'azote liquide 2.
- Conserver à -80 ° C. Un protocole ....
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Discussion
Ce protocole a été développé parce que nous voulions produire un extrait de tissu humain qui est exempt de produits chimiques toxiques tels que les détergents. Plus précisément, nous avons utilisé pour préparer des extraits de tissus humains qui peuvent être utilisés dans des tests de la fonction immunitaire humain in vitro. Les extraits préparés en utilisant ce protocole peut également être reconstitué dans une solution tampon et utilisé pour de nombreuses analyses biochimiques, telles que la chromato.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Ce travail est soutenu par des subventions de l'Australian National de Santé et Medical Research Council (NHMRC # 559007) et la Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) et le Programme d'infrastructure opérationnelle du gouvernement de Victoria. Nous remercions les membres du Tom Mandel Islet programme de l'équipe de transplantation d'isolement des îlots de fournir les tissus humains. Tissus humains ont été recueillis et utilisés avec l'approbation éthique local (Hôpital Saint-Vincent-de-HREC A 011/04 et de santé St. Vincent HREC-A 135/08).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
| 5 ml 12 x 75 mm tubes en polystyrène stériles | BD Falcon | 352054 | |
| Bouchons pour tubes tubes en polystyrène (ci-dessus) | BD Falcon | 352032 | |
| 50ml tubes stériles | Becton Dickinson | 352070 | |
| Acétonitrile | Produits chimiques Mallinckradt | 2856-10 | |
| Butan-1-ol | Sigma Aldrich | 537993-IL | |
| Homogénéisateur: PRO200 | Bio-stratégie | 01-01200 | 10 x 115 mm en dents de scie générateur |
| Lyophiliseur | Virtis, de laboratoire 4K | ||
| Aiguille stérile de calibre 18-20 | Becton Dickinson | REF 302032 | |
| CMRL-1066 Medium | Sigma | C0422 | |
| PBS | Sigma | D8537 |
Tableau 1. Réactifs et équipements spécifiques.
Références
- Mannering, S. I. Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).
- Beckhove, P. Rapid T cell-based identificat....
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