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Biologie

루시 페라 제 Bioluminescence 기자를 사용하여 유전자 발현의 셀 자치 Circadian 시계 리듬을 모니터링

Published: September 27, 2012
doi:
10.3791/4234
, , , ,
1Department of Biological Sciences,The University of Memphis

Summary

Circadian 시계는 개별 세포 내 기능, 즉, 그들은 세포 자율적 있습니다. 여기, 우리는 비 침습적, 루시 페라 기반의 실시간 bioluminescence 기술을 사용하여 셀 자치 클럭 모델을 생성하는 방법을 설명합니다. 리포터 전지는 circadian 생물학을 공부를위한 다루기 쉬운, 기능 모델 시스템을 제공합니다.

Abstract

포유 동물에서 행동과 수면 각성주기와 간 대사 등 생리학의 여러 측면은 내생 circadian 시계 (1,2 검토)에 의해 규제됩니다. circadian 시간 유지 시스템은 동기화와 다른 1,2 추가 – SCN 및 주변 장치 클럭을 조정 suprachiasmatic 핵 (SCN)에있는 중앙 시계와 함께 계층 멀티 발진기 네트워크입니다. 개인 세포가 생성 및 circadian 리듬 3,4, 그리고 유기체 공유에서 다른 조직 유형과 매우 비슷 생화학 부정적인 피드백 메커니즘의 이러한 발진기의 유지 관리를위한 기능 단위입니다. 그러나, SCN의 neuronal 네트워크 수준과 organismal 수준의 리듬, 전신 신호를 통해 ​​상호 작용으로 인해, organismal 수준의 circadian 리듬은 세포 자율적는 5-7 일 필요는 없습니다. 생체 및 SCN explants 예 생체, C의 전위의 활동의 전통 연구에 비해예쁜 기반 세포 자율적 circadian 결함 5,8의 검색을 허용 체외 assays 인치 전략적으로, 셀 기반 모델은 phenotypic 특성화 및 기본 클럭 메커니즘 5,8-13의 급속한 발견에 대한 더 많은 실험적으로 다루기 쉬운 수 있습니다.

circadian 리듬는 동적이기 때문에, 높은 시간적 해상도 길이 측정은 시계 기능을 평가하기 위해 필요합니다. 최근에는 기자로 반딧불의 루시 페라 제를 사용하여 실시간 bioluminescence 기록은 분자 리듬의 인내와 역학의 시험을 수 있으므로, 포유 동물 14,15에 circadian 리듬을 공부를위한 공통의 기술이되었습니다. 유전자 표현의 세포 자치 circadian 리듬을 모니터링하려면 루시 페라 제 기자 과도 transfection 13,16,17 또는 안정적으로 도입 5,10,18,19를 통해 세포에 도입 할 수 있습니다. 여기 lentivirus로 인한 유전자 전달을 사용하여 안정적인 전달 프로토콜을 설명합니다. 티그는 lentiviral 벡터 시스템은 때문에 그 효율성과 기능성의 과도 transfection 및 germline 전송 등의 전통적인 방법으로 우수합니다 : 그것은 분리와 세포 (20)를 비 나누어 모두의 호스트 게놈에 효율적으로 전달하고 안정적인 통합을 할 수 있습니다. 기자 셀 라인이 설정되면, 클럭 기능의 역학은 bioluminescence 기록을 통해 검사 할 수 있습니다. 우리가 처음 P (Per2)-D 루크의 기자 라인, 다음이 및 기타 circadian 기자의 현재 데이터의 생성을 설명합니다. 이러한 assays에서 3T3 마우스 섬유 아세포와 U2OS 인간의 osteosarcoma 세포는 세포 모델로 사용됩니다. 우리는 또한 circadian 연구에서 이러한 클럭 모델을 사용하여 다양한 방법에 대해 논의합니다. 여기에 설명 된 방법은 circadian 시계의 세포와 분자 기초를 공부하는 세포 유형의 훌륭한 다양한에 적용 할 수 있으며, 다른 생물 시스템의 문제를 태클에 유용 할 수 있습니다.

Protocol

1. Lentiviral 루시 페라 제 기자의 건설 포유류의 circadian 기자 구조는 일반적으로 circadian 발기인이 루시 페라 제 유전자와 융합되는 표현 카세트가 포함되어 있습니다. 모두 결합 및 재결합 기반의 전략은 일반적으로 DNA의 복제에 사용됩니다. 예를 들어, 여기에 우리는 불안정한 루시 페라 제 (D 루크)은 마우스 Per2 발기인의 통제하에 있습니다있는 P <em…

Discussion

1. 현재 프로토콜에 대한 수정

1.1 녹화 장치 및 처리량을 고려

때문에 그 상업적 가용성, LumiCycle (Actimetrics)는 실시간 녹화 4,5,9,19,29-31에 가장 일반적으로 사용되는 자동화 된 luminometer 장치가되었습니다. LumiCycle은 매우 높은 감도와 낮은 노이즈 14 제공 빛 감지기로 광전자 증 튜브를 (PMTs) 고용, 따라서 매우 희미 루시 페라 기반 bioluminescence의…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (IOS-0920417) (ACL)에 의해 부분적으로 지원되었다.

Materials

Name of reagent Company Catalogue number Comments
DMEM HyClone SH30243FS For regular cell growth
DMEM Invitrogen 12100-046 For luminometry
FBS HyClone SH3091003  
Pen/Strep/Gln(100x) HyClone SV3008201  
B-27 Invitrogen 17504-044  
D-Luciferin Biosynth L-8220  
Poly-L-lysine Sigma P4707  
Polybrene Millipore TR-1003-G  
Forskolin Sigma F6886  
All other chemicals Sigma    
Equipment
Tissue culture incubator     5% CO2 at 37°C
Tissue culture hood     BSL-2 certified
Light & fluorescent microscope     Phase contrast optional
LumiCycle Actimetrics    
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Cell-autonomous Circadian Clock RhythmsGene ExpressionLuciferase Bioluminescence ReportersMammalian Circadian ClocksSleep-wake CyclesLiver MetabolismEndogenous Circadian ClocksSuprachiasmatic Nucleus (SCN)Peripheral ClocksOscillatorsNegative Feedback MechanismCell-based In Vitro AssaysLocomotor ActivitySCN Explants Ex VivoCell-based ModelsClock FunctionTemporal ResolutionReal-time Bioluminescence RecordingFirefly Luciferase Reporter
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Citer Cet Article
Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters. J. Vis. Exp. (67), e4234, doi:10.3791/4234 (2012).
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