Monitoring Cell-autonome circadiane klok Rhythms of genexpressie met behulp van Luciferase Bioluminescentie Reporters
Summary
Circadiane klokken functioneren binnen de individuele cellen, dat wil zeggen, ze zijn cel-autonoom. We beschrijven werkwijzen voor het genereren van cel-autonome klok modellen niet-invasieve, luciferase-gebaseerde real-time bioluminescentie technologie. Reporter cellen handelbaar, functionele modelsystemen voor het bestuderen van circadiane biologie.
Abstract
In zoogdieren, zijn veel aspecten van het gedrag en de fysiologie, zoals slaap-waak cyclus en de lever metabolisme gereguleerd door endogene circadiane klokken (beoordeeld 1,2). De circadiane tijdwaarneming systeem is een hiërarchisch multi-oscillator-netwerk, met de centrale klok in de suprachiasmatische kern (SCN) synchroniseren en coördineren van extra-SCN en perifere klokken elders 1,2. Individuele cellen de functionele eenheden voor het genereren en onderhouden van circadiane ritmes 3,4, en deze oscillatoren van verschillende weefseltypen in het organisme hebben een opmerkelijk vergelijkbare biochemische mechanisme van negatieve feedback. Vanwege interacties op het neurale netwerk niveau in de SCN en door ritmische, systemische signalen op de organismaal niveau worden circadiane ritmes op organismaal niveau niet noodzakelijk cel-autonome 5-7. Vergeleken met traditionele studies van bewegingsactiviteit in vivo en ex vivo SCN explantaten, cell-gebaseerd in vitro assays zorgen voor ontdekking van cel-autonome circadiane gebreken 5,8. Strategisch, cel-gebaseerde modellen zijn meer experimenteel handelbaarder voor fenotypische karakterisering en snelle ontdekking van de fundamentele klokmechanismen 5,8-13.
Omdat circadiaanse ritmes zijn dynamische, zijn longitudinale metingen met een hoge temporele resolutie die nodig is om klokfunctie te beoordelen. In de afgelopen jaren is real-time opname met bioluminescentie vuurvlieg luciferase reporter als een gebruikelijke techniek voor het bestuderen circadiane ritmes in zoogdieren 14,15, omdat het zorgt voor het onderzoek van de persistentie en dynamica van moleculaire ritmes. Om cel-autonome circadiane ritmes van genexpressie controleren, kan luciferase reporters in cellen worden geïntroduceerd via transiënte transfectie 13,16,17 of stabiele transductie 5,10,18,19. Hier beschrijven we een stabiele transductie protocol met lentivirus gemedieerde genafgifte. Thij lentivirale vector systeem superieur aan traditionele methoden zoals voorbijgaande transfectie en kiemlijntransmissie vanwege de efficiëntie en de veelzijdigheid en maakt het mogelijk efficiënte levering en stabiele integratie in het gastheergenoom van zowel delende als niet-delende cellen 20. Zodra een reporter cellijn wordt vastgesteld, kan de dynamiek van klokfunctie worden onderzocht door middel van bioluminescentie opname. We beschrijven eerst de generatie van P (Per2)-d Luc reporter lijnen, en vervolgens presenteren van gegevens uit deze en andere circadiane verslaggevers. In deze testen worden 3T3 muisfibroblasten en U2OS menselijke osteosarcoomcellen als cellulaire modellen. We bespreken ook de verschillende manieren van het gebruik van deze klok modellen in circadiane studies. Hier beschreven methoden kunnen worden toegepast op een grote verscheidenheid aan celtypen om de cellulaire en moleculaire basis van biologische klok bestuderen en kan nuttig zijn in de aanpak van problemen in andere biologische systemen.
Protocol
Discussion
1. Wijzigingen aan huidige protocol
1.1 Opname apparaten en doorvoer overwegingen
Vanwege de commerciële beschikbaarheid, heeft de LumiCycle (Actimetrics) uitgegroeid tot de meest gebruikte automatische luminometer apparaat voor real-time opname 4,5,9,19,29-31. De LumiCycle werken fotomultiplicatorbuizen (PMTs) als lichtdetectoren, die zeer hoge gevoeligheid en weinig ruis 14 te verschaffen, en is daarom bijzonder geschikt voor data-acquisitie v…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd mede ondersteund door de National Science Foundation (IOS-0920417) (ACL).
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM | HyClone | SH30243FS | For regular cell growth |
| DMEM | Invitrogen | 12100-046 | For luminometry |
| FBS | HyClone | SH3091003 | |
| Pen/Strep/Gln(100x) | HyClone | SV3008201 | |
| B-27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| D-Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| All other chemicals | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Tissue culture incubator | 5% CO2 at 37°C | ||
| Tissue culture hood | BSL-2 certified | ||
| Light & fluorescent microscope | Phase contrast optional | ||
| LumiCycle | Actimetrics |
References
- Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418, 935-941 (2002).
- Hastings, M. H., Reddy, A. B., Maywood, E. S. A clockwork web: circadian timing in brain and periphery, in health and disease. Nat. Rev. Neurosci. 4, 649-661 (2003).
- Nagoshi, E. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119, 693-705 (2004).
- Welsh, D. K. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr. Biol. 14, 2289-2295 (2004).
- Liu, A. C. Intercellular coupling confers robustness against mutations in the SCN circadian clock network. Cell. 129, 605-616 (2007).
- Kornmann, B. System-driven and oscillator-dependent circadian transcription in mice with a conditionally active liver clock. PLoS Biol. 5, e34 (2007).
- Hogenesch, J. B., Herzog, E. D. Intracellular and intercellular processes determine robustness of the circadian clock. FEBS Lett. 585, 1427-1434 (2011).
- DeBruyne, J. P., Weaver, D. R., Reppert, S. M. Peripheral circadian oscillators require CLOCK. Curr. Biol. 17, 538-539 (2007).
- Liu, A. C. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4, e1000023 (2008).
- Zhang, E. E. A genome-wide RNAi screen for modifiers of the circadian clock in human cells. Cell. 139, 199-210 (2009).
- Baggs, J. E. Network features of the mammalian circadian clock. PLoS Biol. 7, e52 (2009).
- Hirota, T. High-throughput chemical screen identifies a novel potent modulator of cellular circadian rhythms and reveals CKIalpha as a clock regulatory kinase. PLoS Biol. 8, e1000559 (2010).
- Ukai-Tadenuma, M. Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function. Cell. 144, 268-281 (2011).
- Yamazaki, S., Takahashi, J. S. Real-time luminescence reporting of circadian gene expression in mammals. Methods Enzymol. 393, 288-301 (2005).
- Welsh, D. K., Imaizumi, T., Kay, S. A. Real-time reporting of circadian-regulated gene expression by luciferase imaging in plants and mammalian cells. Methods Enzymol. 393, 269-288 (2005).
- Sato, T. K. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function. Nat. Genet. 38, 312-319 (2006).
- Ueda, H. R. System-level identification of transcriptional circuits underlying mammalian circadian clocks. Nat. Genet. 37, 187-192 (2005).
- Brown, S. A. The period length of fibroblast circadian gene expression varies widely among human individuals. PLoS Biol. 3, e338 (2005).
- Hirota, T. A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20746-20751 (2008).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Ueda, H. R. A transcription factor response element for gene expression during circadian night. Nature. 418, 534-539 (2002).
- Zufferey, R., Donello, J. E., Trono, D., Hope, T. J. Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances expression of transgenes delivered by retroviral vectors. J. Virol. 73, 2886-2892 (1999).
- Buhr, E. D., Yoo, S. H., Takahashi, J. S. Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators. Science. 330, 379-385 (2010).
- Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, . U.A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
- Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A., Lundkvist, G. B. S. Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus. J. Vis. Exp. (48), e2439 (2011).
- Akashi, M., Ichise, T., Mamine, T., Takumi, T. Molecular mechanism of cell-autonomous circadian gene expression of Period2, a crucial regulator of the mammalian circadian clock. Mol. Biol. Cell. 17, 555-565 (2006).
- Ohno, T., Onishi, Y., Ishida, N. A novel E4BP4 element drives circadian expression of mPeriod2. Nucleic Acids Res. 35, 648-655 (2007).
- Maier, B. A large-scale functional RNAi screen reveals a role for CK2 in the mammalian circadian clock. Genes Dev. 23, 708-718 (2009).
- Yoo, S. H. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 5339-5346 (2004).
- Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets. Nat. Chem. Biol. 3, 630-639 (2007).
- Ko, C. H. Emergence of noise-induced oscillations in the central circadian pacemaker. PLoS Biol. 8, e1000513 (2010).
- Izumo, M., Johnson, C. H., Yamazaki, S. Circadian gene expression in mammalian fibroblasts revealed by real-time luminescence reporting: temperature compensation and damping. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16089-16094 (2003).
- Izumo, M., Sato, T. R., Straume, M., Johnson, C. H. Quantitative analyses of circadian gene expression in mammalian cell cultures. PLoS Comput. Biol. 2, e136 (2006).
- Chen, Z. Identification of diverse modulators of central and peripheral circadian clocks by high-throughput chemical screening. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 101-106 (2011).
- Yamaguchi, S. Synchronization of cellular clocks in the suprachiasmatic nucleus. Science. 302, 1408-1412 (2003).
- Akashi, M., Hayasaka, N., Yamazaki, S., Node, K. Mitogen-activated protein kinase is a functional component of the autonomous circadian system in the suprachiasmatic nucleus. J. Neurosci. 28, 4619-4623 (2008).
- Hoshino, H., Nakajima, Y., Ohmiya, Y. Luciferase-YFP fusion tag with enhanced emission for single-cell luminescence imaging. Nat. Methods. 4, 637-639 (2007).
- Asai, M. Visualization of mPer1 transcription in vitro: NMDA induces a rapid phase shift of mPer1 gene in cultured SCN. Curr. Biol. 11, 1524-1527 (2001).
- Wilsbacher, L. D. Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 489-494 (2002).
- Yamazaki, S. Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Welsh, D. K., Noguchi, T., Yuste, R. Cellular bioluminescence imaging. Imaging: A Laboratory Manual. , 369-385 (2011).
- Nakajima, Y. Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One. 5, e10011 (2010).
- Guilding, C. A riot of rhythms: neuronal and glial circadian oscillators in the mediobasal hypothalamus. Mol. Brain. 2, 28 (2009).
- O’Neill, J. S. cAMP-dependent signaling as a core component of the mammalian circadian pacemaker. Science. 320, 949-953 (2008).
- Fuller, P. M., Lu, J., Saper, C. B. Differential rescue of light- and food-entrainable circadian rhythms. Science. 320, 1074-1077 (2008).
- Mukherjee, S. Knockdown of Clock in the ventral tegmental area through RNA interference results in a mixed state of mania and depression-like behavior. Biol. Psychiatry. 68, 503-511 (2010).
- Saijo, K. A Nurr1/CoREST pathway in microglia and astrocytes protects dopaminergic neurons from inflammation-induced death. Cell. 137, 47-59 (2009).
- Elias, G. M. Synapse-specific and developmentally regulated targeting of AMPA receptors by a family of MAGUK scaffolding proteins. Neuron. 52, 307-320 (2006).
- Isojima, Y. CKIepsilon/delta-dependent phosphorylation is a temperature-insensitive, period-determining process in the mammalian circadian clock. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 15744-15749 (2009).
- Bucan, M., Abel, T. The mouse: genetics meets behaviour. Nat. Rev. Genet. 3, 114-123 (2002).
- Hughes, M. E. Harmonics of circadian gene transcription in mammals. PLoS Genet. 5, e1000442 (2009).
- Atwood, A. Cell-autonomous circadian clock of hepatocytes drives rhythms in transcription and polyamine synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 18560-18565 (2011).
- Panda, S. Coordinated transcription of key pathways in the mouse by the circadian clock. Cell. 109, 307-320 (2002).
