Primer insan T hücrelerinin piggyBac Transposon Sistem Modifikasyon
Summary
Bu genetik olarak non-viral kullanılarak bir transgen ile primer insan T-hücreleri değiştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır<em> PiggyBac</em> Transpozon sistemi. T hücreleri ile değiştirilmiş<em> PiggyBac</em> Transpozon sistemi sergi kararlı transgen ifadesi.
Abstract
PiggyBac transpozon sistemi başlangıçta lahana lüper güve 1,2 türetilen, doğal olarak aktiftir. Bu non-viral bir sistem en sık bir piggyBac transposase enzim ve gen transfer aktivitesi için gerekli olan ters çevrilmiş tekrar elemanları arasında ilgi gen (ler) i barındıran bir transpozon plazmid ifade ile plazmitler kullanılarak, plazmid bazlı olup. PiggyBac aracılık gen transferi yoluyla transposase ilgi hedef hücre (ler) in genom içine entegre transpozon bölüm vasıtasıyla bir "kesme ve yapıştırma" mekanizması. piggyBac 3-5 memeli böcek 1,2, geniş bir çeşitlilik içinde verimli gen dağıtım aktivite göstermiş, ve etmiştir 7,8 primer insan T-hücreleri de dahil olmak üzere insan cells6. Son zamanlarda, bir hiperaktif piggyBac transposase gen aktarım verimliliği 9,10 geliştirmeye oluşturuldu.
İnsan T lenfositleri klinik Intere taşımaktadırKanser 11 evlatlık immünoterapi için st. Unutmayın ki, Sleeping beauty transpozon sistemi kullanılarak insan T hücrelerinin transpozon değişiklik içeren ilk klinik deneme 12 onaylandı. Biz daha önce insan T hücrelerinin genetik modifikasyonu için bir non-viral metodoloji olarak piggyBac yararlılığını değerlendirdik. Bir raportör gen ve bir imünojenik olmayan indüklenebilir intihar geni 7 ile insan T hücrelerinin genetik modifikasyonu olarak etkin olduğu piggyBac bulundu. Genomik entegrasyon siteleri Analizi 13 içine veya bilinen proto-onkogenler yakın entegrasyon için tercih eksikliği saptandı. Bu tümör antijen HER2 karşı yöneltilmiş bir kimerik antijen reseptörü taşımak için gen değiştirme sitotoksik T lenfositleri üzerinde piggyBac kullanılır ve gen ile modifiye edilmiş T hücreleri ortotopik bir fare modelinde in vitro ve in vivo HER2-pozitif tümör hücre öldürme aracılı hedef olduğunu buldu 14. Ayrıca piggyBac kullanılmıştırrapamisinin 15 kullanılmaktadır kanser tedavilerinde yararlı olacaktır rapamisin karşı dirençli insan T-hücreleri, elde edilmektedir.
Burada, genetik olarak primer insan T-hücreleri değiştirmek için piggyBac kullanılması için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu kültür, gen modifikasyonu, ve T hücrelerinin aktivasyonunu takiben insan kanı alınan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) izolasyonu içerir. Bu rapor amacı için, T-hücreleri akış sitometrisi ile gen ekspresyonu analizi ve ölçümü için bir raportör gen (eGFP) ile modifiye edildi.
PiggyBac ilgi genlerinin çeşitli insan T-hücreleri değiştirmek için de kullanılabilir. , Tümör antijenleri 14 ile T hücreleri yönlendirmek için piggyBac kullanılmış olmasına rağmen, aynı zamanda, gerekirse 7 geninin değiştirilmiş hücreleri ortadan kaldırmak için bir indüklenebilir emniyet şalteri eklemek için piggyBac kullanılmıştır. PiggyBac arasında büyük kargo kapasitesi de gen transferi sağladıBüyük bir rapamisin dirençli mTOR molekülü (15 kb) 15. Bu nedenle, bu amaç için çok çeşitli primer insan T-hücrelerinin kararlı gen değiştirme için bir non-viral bir yöntem sunulmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan yöntem, primer insan T hücrelerinin kararlı transgen değiştirilmesini sağlar. Biz daha önce bir muhabir gen (en fazla 4 hafta), olmayan bir immünojenik intihar gen, evlatlık immünoterapi için bir kimerik antijen reseptör (100 günden fazla) için, ifade T hücreleri değiştirmek için piggyBac transpozon sisteminin kullanımını test ettik ve immünsüpresif ilaçlar 7,13-15 direnç mühendisi. Evlatlık immünoterapi ve diğer uygulamalar için T hücrelerinin Sigara…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SS TBMM Programı aracılığıyla Grad Eğitimi Hibe içine HHMI Med tarafından kısmen desteklenmektedir. MHW Gazi İşleri Bakanlığı bir kariyer geliştirme ödülü ve Dr ve Bayan Harold M. Selzman ve cömert destek kısmen desteklenmektedir. Bu çalışma aynı zamanda NIH lenfoma SPORE hibe P50CA126752 ve NIH R01 DK093660 tarafından kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| Advanced RPMI 1,640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| GlutaMAX-I Supplement | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| Human IL-15 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
| Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| Anti-Human CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| Anti-Human CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 24 Well Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 24 Well Non Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 351147 | |
| Complete T cell media composition 1x Advanced RPMI 1,640 5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I |
References
- Cary, L. C. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology. 172 (1), 156 (1989).
- Fraser, M. J. Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA. Virology. 211 (2), 397 (1995).
- Ding, S. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473 (2005).
- Saridey, S. K. PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer. Mol. Ther. 17 (12), 2115 (2009).
- Nakanishi, H. piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice. Mol. Ther. 18 (4), 707 (2010).
- Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells. Mol. Ther. 15 (1), 139 (2007).
- Nakazawa, Y. Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes. J. Immunother. 32 (8), 826 (2009).
- Raja Manuri, P. V. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21 (4), 427 (2010).
- Doherty, J. E. Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo. Hum. Gene Ther. , (2011).
- Yusa, K. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531 (2011).
- Bonini, C. Genetic modification of T cells. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, S15-S20 (2011).
- Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18 (4), 1531 (2010).
- Galvan, D. L. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J. Immunother. 32 (8), 837 (2009).
- Nakazawa, Y. PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor. Mol. Ther. 19 (12), 2133 (2011).
- Huye, L. E. Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination. Mol. Ther. 19 (12), 2239 (2011).
- Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex). J. Immunother. 33 (3), 305 (2010).
- Kahlig, K. M. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343 (2010).
