Summary

Glycan Profilering av Plant Cell Wall Polymers med Mikromatriser

Published: December 17, 2012
doi:

Summary

En teknikk som kalles<strong> C</strong> Omprehensive<strong> M</strong> Icroarray<strong> P</strong> Olymer profilering (CoMPP) for karakterisering av plante cellevegg glykaner er beskrevet. Denne metoden kombinerer spesifisitet av monoklonale antistoffer rettet mot definerte glycan-epitoper med en miniatyr microarray analytisk plattform som tillater screening av glycan forekomst i et bredt spekter av biologiske sammenhenger.

Abstract

Plant celleveggene er komplekse matriser av heterogene glykaner som spiller en viktig rolle i fysiologi og utvikling av planter og gi råstoff for menneskelige samfunn (for eksempel tre, papir, tekstiler og biobrensel industri) 1,2. Men, forstå biosyntesen og funksjon av disse komponentene forblir utfordrende.

Cellevegg glykaner er kjemisk og conformationally mangfoldig på grunn av kompleksiteten i deres byggeklosser, de glykosyl rester. Disse danner bindinger ved flere posisjoner og skiller seg i ringstruktur, isomerisk eller anomere konfigurasjon, og i tillegg er substituert med en rekke ikke-sukkerrester. Glycan sammensetningen varierer i forskjellige celle-og / eller vevstyper eller selv sub-domener av en enkelt celle vegg 3. Videre er deres sammensetning også modifisert under utviklingen 1, eller i respons til miljømessige signaler 4.

I exsessen av 2000 gener har er Plant celleveggene komplekse matriser av heterogene glykaner blitt spådd å være involvert i celleveggen glycan biosyntese og modifikasjon i Arabidopsis 5. Imidlertid har relativt få av biosyntetiske gener blitt funksjonelt karakterisert 4,5. Omvendt genetikk tilnærminger er vanskelig fordi genene er ofte forskjellig uttrykk, ofte på lave nivåer, mellom celletyper 6. Dessuten er mutant studier ofte hindret av genet redundans eller kompenserende mekanismer for å sikre hensiktsmessig celleveggen funksjon opprettholdes 7. Dermed nye tilnærminger for å raskt karakterisere det varierte utvalget av sukkerkjedene strukturer og legge til rette funksjonell genomikk tilnærminger til forståelse celleveggen biosyntese og modifikasjon.

Monoklonale antistoffer (mAbs) 8,9 har dukket opp som et viktig verktøy for å bestemme glycan struktur og distribusjon i planter. Disse gjenkjenner distinct epitoper til stede innenfor store klasser av plante cellevegg glykaner, inkludert pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glukaner og arabinogalactans. Nylig bruken har blitt utvidet til store screening eksperimenter for å bestemme den relative overflod av glykaner i et bredt spekter av anlegg og vevstyper samtidig 9,10,11.

Her presenterer vi en microarray-baserte glycan screening metode som kalles Omfattende Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (figur 1 og 2) 10,11 som gjør at flere prøver (100 sek) skal skjermes ved hjelp av en miniatyrisert microarray plattform med redusert reagens og prøvevolumer. Spot signaler på microarray kan bli formelt kvantifisert å gi semi-kvantitative data om glycan epitop forekomst. Denne tilnærmingen er godt egnet til å spore endringer i sukkerkjedene komplekse biologiske systemer 12 og gir en global oversikt over celleveggen preparat spesielt når forkunnskaper of dette er utilgjengelig.

Protocol

1. Tissue Collection og klargjøring Samle 100 mg frisk vekt plantemateriale (minimum 10 mg tørrvekt) i minst tre eksemplarer for hvert vev av interesse. Følgende trinn beskriver fremstillingen av celleveggen materiale fra vegetative vev. I tilfelle av lagring vev, er un-ettersøkte stivelse enzymatisk fjernes før fortsetter med utvinning av cellevegg polymerer som tidligere beskrevet 13. Homogenisere prøvene til et fint pulver med flytende nitrogen ved hjelp av en Qiagen TissueLyser …

Representative Results

Den relative overflod av glykaner i seks vevstyper (anther filamenter, pollen, eggstokker, kronblad, begerblad og stigma) fra Nicotiana Alata blomster ble fastsatt ved hjelp CoMPP. Fig. 3A viser et representativt microarray som har blitt analysert med mAb JIM5 spesifikk for delvis (lav) metylforestringsgrad homogalacturonan (HG), en epitop som forekommer på pektinstoffer polysakkarider 14. Den JIM5 epitop er oppdaget i CDTA ekstrakter av alle blomst vev er imidlertid høyest i pollen og lavest i sti…

Discussion

CoMPP er en rask og følsom metode for å profilere glycan sammensetningen av hundrevis plante-avledet prøver i løpet av noen dager. Denne metoden utfyller de allerede tilgjengelige bakterielle eller mammalske sukkerkjedene rekke plattformer for high-throughput screening av karbohydrat interaksjoner med glycan-bindende proteiner som lektiner, reseptorer, og antistoffer 16. Med et stort mangfold av sonder tilgjengelige for detektering cellevegg glykaner, er det mulig å få informasjon om sukkerkjedene epito…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

IEM ønsker å takke den danske Forskningsrådet (FTP og FNU) for finansiering. ERL erkjenner støtte fra en ARC DP stipend. AB erkjenner støtte fra ARC Centre of Excellence i Plant Cell Walls stipend.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
3 mm Tungsten Carbide beads Qiagen 69997  
Collection microtubes (1.2 mm) Qiagen 19560 1.5 ml microfuge tubes can also be used
Qiagen TissueLyser II Qiagen 85300  
3 mm glass beads Sigma Aldrich Z143928  
CDTA Sigma Aldrich 34588  
Cadmium oxide Sigma Aldrich 202894  
1,2-diaminoethane Sigma Aldrich 03550  
Nitrocellulose membrane (0.22 μm pore size) GE-water & process technologies EP2HY00010 different pore sized membranes are suitable for different pin types
Xact II microarrayer robot Labnext 001A the Xact II robot was fitted with a custom 20 x 20 cm ceramic plate to which the nitrocellulose membrane is attached
Xtend RM microarray pins Labnext 0037-350 pins must be suitable for spotting on membranes
384 well microtiter plates (polypropylene) Greiner 781207  
Anti-glycan monoclonal antibodies Plant Probes/
CarboSource/Biosupplies
  Websites; PlantProbes (www.plantprobes.net), Carbosource (www.carbosource.net) and Biosupplies (www.biosupplies.com.au).
Anti-Rat IgG (whole molecule) – Peroxidase antibody produced in goat. Sigma A9037 the type of secondary antibodies depends on the primary antibody used (e.g. raised in rat, mouse, goat etc).
SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets Sigma D4293 the type of developing reagent depends on the secondary antibodies used and the detection method (colourmetric, or chemiluminecent).
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermoscientific 34080 see above
Xplore Image Processing Software LabNext 008 many software types with automatic gridding tools are available to measure pixel value of microarray spots.
Plant polysaccharides Sigma/Megazyme    

References

  1. Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J. 3, 1-30 (1993).
  2. Somerville, C. Biofuels. Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).
  3. Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion. J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).
  4. Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. Plant cell walls: the skeleton of the plant world. Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).
  5. Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics. Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).
  6. Sarria, R., Wagner, T. A., O’Neill, M. A., Faik, A., et al. Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1. Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).
  7. Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. Toward a systems approach to understanding plant cell walls. Science. 306, 2206-2211 (2004).
  8. Willats, W. G. T., Knox, J. P., Rose, J. K. C. Molecules in context: probes for cell wall analysis. The Plant Cell Wall. , 92-110 (2003).
  9. Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies. Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).
  10. Moller, I. E., Sørensen, I., Bernal, A. J., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).
  11. Sørensen, I., Willats, W. G. T. Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays. Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).
  12. Moller, I. E., Licht, D. e. F. i. n. e., Harholt, H. H., J, , et al. The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens. PLoS One. 6 (3), e17506 (2011).
  13. Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. , (2012).
  14. Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7. Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).
  15. Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. Plant J. 59, 413-425 (2009).
  16. Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray. Current Protocols in Protein Science. , (2011).
  17. McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules. PNAS. 103, 4765-4770 (2006).
  18. Caño-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana. Development. 127, 3395-3405 (2000).
  19. Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea. Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).
  20. Updegraff, D. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).
  21. 21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).
  22. Sørensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. Mixed linkage (1→3),(1→4)-β-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls. Plant J. 54 (13), 510-521 (2008).
  23. Domozych, D. S., Sørensen, I., Willats, W. G. T. The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara. 2104, 1045-1056 (2009).
  24. Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles. Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).
  25. Øbro, J., Sørensen, I., Derkx, P., et al. High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays. Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).
check_url/fr/4238?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Moller, I. E., Pettolino, F. A., Hart, C., Lampugnani, E. R., Willats, W. G., Bacic, A. Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays. J. Vis. Exp. (70), e4238, doi:10.3791/4238 (2012).

View Video