Mikroarray'ler kullanarak Bitki Hücre Duvarı Polimerlerin glukanıdır Profilleme
Summary
Denilen bir tekniği<strong> C</strong> Omprehensive<strong> M</strong> Icroarray<strong> P</strongBitki> olymer profil (CoMPP) tarif edilir. Bu yöntem, biyolojik bağlamlarda geniş bir aralıkta glikan geçtiği tarama izin veren bir minyatür mikrodizi analitik platformu ile tanımlanan glikan-epitoplara karşı yönelik monoklonal antikorlar özgüllük birleştirir.
Abstract
Bitki hücre duvarları fizyolojisi ve bitki gelişmesinde önemli bir rol oynar ve insan topluluklarının (örneğin tahta, kağıt, tekstil ve biyoyakıt endüstrisi) 1,2 için hammadde sağlamak heterojen glukanlardır karmaşık matrisler vardır. Bununla birlikte, bu bileşenlerin biyosentezini ve işlevlerini anlamada zorlu kalır.
Hücre duvarı glukanlardır kimyasal ve yapı taşları, glikozil kalıntılarının karmaşıklığı nedeniyle conformationally çeşitlidir. Bu formu çoklu pozisyonlarda bağlar ve halka yapısı farklı, izomerik ya da anomerik konfigürasyon, ve ek olarak, non-şeker artıkları bir dizi ile sübstitüe edilmiştir. Glukanıdır kompozisyonu hatta farklı hücre ve / veya doku tipleri veya tek bir hücre duvarı 3 alt alan adları değişir. Ayrıca, bunların bileşimi, aynı zamanda 1 geliştirme sırasında, ya da çevresel işaret 4 yanıt olarak modifiye edilir.
Ex2.000 genlerin cess Bitki hücre duvarlarının heterojen glukanlardır karmaşık matrisler Arabidopsis 5 hücre duvarı glukanıdır biyosentezi ve modifikasyonu yer alacağı öngörülmüştür olanlarıdır. Bununla birlikte, biyosentez genlerinin göreceli olarak az sayıda işlevsel olarak 4,5 karakterize edilmiştir. Genlerin çoğu zaman farklı olarak hücre tipleri 6 arasında, sık sık düşük seviyelerde ifade edilir çünkü karşıt genetik yaklaşım zordur. Ayrıca, mutant çalışmalar genellikle uygun hücre duvarı işlevi 7 korunmasını sağlamak için gen fazlalık veya telafi edici mekanizmalar tarafından engellenmiştir. Böylece yeni yaklaşımları hızla glukanıdır yapıların çeşitli karakterize etmek ve anlayış hücre duvarı biyosentezi ve modifikasyonu fonksiyonel genomik yaklaşımlar kolaylaştırmak için ihtiyaç vardır.
Monoklonal antikor (mAb) 8,9 Bitkilerde glukanıdır yapısı ve dağılımı belirlenmesi için önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu dist tanımakpektinler, xyloglucans, xylans, mannans, glukan ve arabinogalactans gibi bitki hücre duvarının glukanlardır ana sınıfları, içinde bulunan inct epitoplar. Son zamanlarda bunların kullanımı bitki ve doku tipleri eşzamanlı 9,10,11 geniş bir yelpazede glukanlardır göreli bolluğu belirlemek için geniş çaplı tarama deneyler kadar uzatılmıştır.
Burada düşük reaktif ve numune hacimleri ile minyatür bir mikroarray platformu kullanarak ekranlı olması (100 sn) çoklu örnekleri sağlar Kapsamlı Mikroarray Polimer Profiling (CoMPP) (Şekil 1 ve 2) 10,11 adlı bir mikroarray tabanlı glukanıdır tarama yöntemi sunuyoruz. Mikroarray üzerinde nokta işaretleri resmen glukanıdır epitop oluşumu hakkında yarı-nicel veri vermek için ölçülebilir. Bu yaklaşım karmaşık biyolojik sistemlerin 12 glukanıdır değişiklikleri izleme ve hücre duvarı kompozisyonları küresel bir bakış sağlamak için uygundur, özellikle önceki bilgilerif Bu kullanılamıyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
CoMPP birkaç gün içinde yüzlerce bitkisel kaynaklı numunelerin glukanıdır kompozisyonu profilleme için hızlı ve hassas bir yöntemdir. Bu yöntem, lektinler, reseptörleri ve antikorları 16 gibi glukanıdır-bağlayıcı proteinler ile karbohidrat etkileşimleri yüksek verimli tarama zaten mevcut bakteriyel veya memeli glukanıdır dizi platformlar tamamlar. Hücre duvarı glukanlardır tespit etmek için kullanılabilir probları geniş bir çeşitliliği ile, bitki hücre duvarı 8,9 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IEM finansman Danimarka Araştırma Konseyi (FTP ve FNU) kabul etmek istiyorum. ERL bir ARC DP hibe desteği kabul etmektedir. AB Bitki hücre duvarları hibe Mükemmellik ARC Merkezi'nin desteği ile hazırlanmıştır.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 3 mm Tungsten Carbide beads | Qiagen | 69997 | |
| Collection microtubes (1.2 mm) | Qiagen | 19560 | 1.5 ml microfuge tubes can also be used |
| Qiagen TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| 3 mm glass beads | Sigma Aldrich | Z143928 | |
| CDTA | Sigma Aldrich | 34588 | |
| Cadmium oxide | Sigma Aldrich | 202894 | |
| 1,2-diaminoethane | Sigma Aldrich | 03550 | |
| Nitrocellulose membrane (0.22 μm pore size) | GE-water & process technologies | EP2HY00010 | different pore sized membranes are suitable for different pin types |
| Xact II microarrayer robot | Labnext | 001A | the Xact II robot was fitted with a custom 20 x 20 cm ceramic plate to which the nitrocellulose membrane is attached |
| Xtend RM microarray pins | Labnext | 0037-350 | pins must be suitable for spotting on membranes |
| 384 well microtiter plates (polypropylene) | Greiner | 781207 | |
| Anti-glycan monoclonal antibodies | Plant Probes/ CarboSource/Biosupplies |
Websites; PlantProbes (www.plantprobes.net), Carbosource (www.carbosource.net) and Biosupplies (www.biosupplies.com.au). | |
| Anti-Rat IgG (whole molecule) – Peroxidase antibody produced in goat. | Sigma | A9037 | the type of secondary antibodies depends on the primary antibody used (e.g. raised in rat, mouse, goat etc). |
| SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | the type of developing reagent depends on the secondary antibodies used and the detection method (colourmetric, or chemiluminecent). |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermoscientific | 34080 | see above |
| Xplore Image Processing Software | LabNext | 008 | many software types with automatic gridding tools are available to measure pixel value of microarray spots. |
| Plant polysaccharides | Sigma/Megazyme |
References
- Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J. 3, 1-30 (1993).
- Somerville, C. Biofuels. Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).
- Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion. J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).
- Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. Plant cell walls: the skeleton of the plant world. Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).
- Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics. Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).
- Sarria, R., Wagner, T. A., O’Neill, M. A., Faik, A., et al. Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1. Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).
- Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. Toward a systems approach to understanding plant cell walls. Science. 306, 2206-2211 (2004).
- Willats, W. G. T., Knox, J. P., Rose, J. K. C. Molecules in context: probes for cell wall analysis. The Plant Cell Wall. , 92-110 (2003).
- Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies. Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).
- Moller, I. E., Sørensen, I., Bernal, A. J., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).
- Sørensen, I., Willats, W. G. T. Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays. Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).
- Moller, I. E., Licht, D. e. F. i. n. e., Harholt, H. H., J, , et al. The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens. PLoS One. 6 (3), e17506 (2011).
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. , (2012).
- Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7. Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).
- Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. Plant J. 59, 413-425 (2009).
- Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray. Current Protocols in Protein Science. , (2011).
- McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules. PNAS. 103, 4765-4770 (2006).
- Caño-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana. Development. 127, 3395-3405 (2000).
- Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea. Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).
- Updegraff, D. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).
- 21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).
- Sørensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. Mixed linkage (1→3),(1→4)-β-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls. Plant J. 54 (13), 510-521 (2008).
- Domozych, D. S., Sørensen, I., Willats, W. G. T. The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara. 2104, 1045-1056 (2009).
- Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles. Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).
- Øbro, J., Sørensen, I., Derkx, P., et al. High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays. Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).
