Vi beskriver en ny fremgangsmåde til isolering af genomisk DNA fra fuldblod ved plasma / serologi. Efter plasma kollektion er den komprimerede blodet normalt kasseres. Vores hidtil ukendte fremgangsmåde udgør en betydelig forbedring i forhold til eksisterende metoder og gør DNA og plasma fås fra en enkelt samling, uden at anmode om yderligere blod.
Laboratorieundersøgelser kan gøres på de cellulære eller flydende dele af blodet. Anvendelsen af forskellige blodopsamlingsrør bestemmer del af blodet, der kan analyseres (fuldblod, plasma eller serum). Laboratorier involveret i at studere den genetiske grundlag af menneskelige lidelser er afhængige af antikoaguleret fuldblod opsamlet i EDTA-holdige Vacutainer som kilde af DNA til genetisk / genomisk analyse. Fordi de fleste kliniske laboratorier udfører biokemiske, serologiske og viral afprøvning som et første skridt i fænotypisk udfald undersøgelse, antikoaguleret blod også opsamlet i heparin-holdige rør (plasma rør). Derfor når DNA og plasma er nødvendige for samtidige og parallelle analyser af både genomiske og proteomiske data, er det almindeligt at samle blod i både EDTA og heparin rør. Hvis blod kan indsamles i et enkelt rør, og tjene som en kilde til både plasma og DNA, ville denne metode blive betragtet som en avancement til eksisterende methods. Brugen af den komprimerede blod efter plasma udvinding repræsenterer en alternativ kilde til genomisk DNA, og dermed minimere mængden af blod behandlede prøver og reducere antallet af nødvendige prøver fra hver patient. Dette ville i sidste ende spare tid og ressourcer.
BD P100 blodtapning system til plasmaprotein konservering blev oprettet som en forbedret metode i forhold til tidligere plasma eller serum samling rør 1, for at stabilisere proteinindholdet i blodet, så bedre protein biomarkør opdagelse og proteomics eksperimenter fra humant blod. BD P100 rør indeholder 15,8 ml spraytørret K2EDTA og en frysetørret proprietære bredspektret cocktail af proteaseinhibitorer for at hindre koagulation og stabilisere plasmaproteiner. De omfatter også en mekanisk separator, som giver en fysisk barriere mellem plasma og cellebundfald efter centrifugering. Kun få metoder er blevet udviklet til at udvinde DNA fra størknet blod samples indsamlet i gamle plasma rør 2-4. Udfordringer fra disse metoder blev primært forbundet med den type separator inde i rørene (gel separator) og omfattede vanskeligt inddrive størknet blod, besværet med fragmentering eller dispergering af blodprop, og obstruktion af blodprop ekstraktion ved separation gelen.
Vi præsenterer den første metode, som trækker og renser genomisk DNA fra blod trukket i de nye BD P100 rør. Vi sammenligne kvaliteten af DNA-prøven fra P100 rør til at fra EDTA-rør. Vores tilgang er enkel og effektiv. Det indebærer fire store trin som følger: 1) brug af et plasma BD P100 (BD Diagnostics, gnister, MD, USA) rør med mekanisk separator for blodprøvetagning, 2) fjernelse af den mekaniske separator ved hjælp af en kombination af saccharose og en steril papirclips metallisk krog, 3) udskillelse af buffy coat lag indeholdende de hvide celler og 4) isolering af genomisk DNA fraBuffy coat hjælp af en almindelig kommerciel DNA ekstraktion kit eller en lignende standard protokol.
Mange menneskelige sygdomme har genetiske årsager og udforske det genetiske grundlag for sygdomme hos mennesker kræver en stigende høj kvalitet DNA. Den mest almindelige kilde af DNA, der anvendes i genetiske undersøgelser er antikoaguleret fuldblod. Fordi de fleste kliniske laboratorier udfører biokemiske, serologiske og viral afprøvning som et første skridt i fænotypisk udfald undersøgelse, blodet ofte opsamles i et plasma rør. Efter opsamling af plasmaet, er den komprimerede blod ofte kasseres. Derfor, når…
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number |
BD P100 tubes | BD Diagnostics | 366448 |
EDTA tubes | BD Diagnostics | 367863 |
Sucrose | Sigma | S9378 |
Paper clip | Office product | |
15 ml tube | Corning | 430052 |
Red blood cells (RBC) | Qiagen | 158389 (kit) |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Thermo Scientific | SH30256.01 |
BioSprint 96 DNA Blood Kit (48) | Qiagen | 940054 |
1.7 ml microtubes | Axygen | MCT-175-C |
Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit | Illumina | WG-352-1001 |
Bead array reader | Illumina | NA |
GenomeStudio Software | Illumina | N/A |