Um método prático e inovador para extrair DNA genômico de Kits de coleta de sangue para Preservação Plasma Protein

Summary

Estamos a descrever um novo método de isolamento de DNA genómico a partir de sangue total recolhido de plasma / sorologia. Após a coleta de plasma, o sangue compactado é geralmente descartado. O novo método represente uma melhoria significativa em relação aos métodos existentes e torna o ADN disponível e de plasma a partir de um único conjunto, sem solicitar sangue adicional.

Abstract

Testes de laboratório pode ser feito nas porções celulares ou fluidos do sangue. O uso de diferentes tubos de colheita de sangue determina a porção do sangue que pode ser analisada (sangue completo, plasma ou soro). Os laboratórios que participam no estudo da base genética de doenças humanas dependem de sangue inteiro anti-coagulado recolhido em EDTA vacutainer contendo como fonte de ADN para a análise genética / genómico. Porque a maioria dos laboratórios clínicos realizar testes bioquímicos, sorológicos e virais, como um primeiro passo na investigação fenotípica resultado, o sangue anticoagulado é também recolhida no tubo contendo heparina (tubo de plasma). Portanto, quando o ADN e de plasma são necessários para a análise simultânea e em paralelo de dados, tanto ao genoma e proteoma, é comum recolher o sangue em EDTA e ambos tubos de heparina. Se o sangue pode ser recolhido num tubo e servir como uma fonte de plasma e de DNA, que o método poderia ser considerado como um avanço à metanfetamina existenteods. A utilização do sangue compactados, após extracção de plasma representa uma fonte alternativa de ADN genómico, minimizando assim a quantidade de amostras de sangue e processadas a redução do número de amostras necessário para cada paciente. Este acabaria por economizar tempo e recursos.

O sistema de coleta de sangue P100 BD para a preservação proteínas plasmáticas foram criados como um método melhorado ao longo plasma anterior ou recolha de soro tubos ^1, para estabilizar o teor de proteína do sangue, permitindo uma melhor descoberta de biomarcadores de proteínas e proteômica experimentação a partir de sangue humano. Os tubos P100 BD contêm 15,8 ml de K2EDTA seca por pulverização e um vasto espectro de propriedade liofilizado coquetel de inibidores de protease para impedir a coagulação e estabilizar as proteínas do plasma. Eles também incluem um separador mecânico, que proporciona uma barreira física entre o plasma e os sedimentos celulares após centrifugação. Alguns métodos foram desenvolvidos para extrair DNA de sangue coagulado SAmples coletadas em tubos de plasma de idade ^2-4. Os desafios de estes métodos foram associados principalmente com o tipo de separador no interior dos tubos (separador de gel) e às dificuldades na recuperação do sangue coagulado, o inconveniente de fragmentação ou de dispersão do coágulo e obstrução do coágulo por extracção do gel de separação.

Nós apresentamos o primeiro método que extrai e purifica o DNA genômico de sangue coletado nos novos tubos BD P100. Comparamos a qualidade da amostra de ADN a partir de P100 tubos para que a partir de tubos com EDTA. Nossa abordagem é simples e eficiente. Ela envolve quatro passos principais como se segue: 1) o uso de um BD P100 plasma (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) com separador mecânico de tubos para colheita de sangue, 2) a remoção do separador mecânico usando uma combinação de sacarose e um clipe estéril gancho metálico, 3) a separação da camada de cobertura amarelada que contém os glóbulos brancos e 4) o isolamento do ADN genómico dobuffy coat usando um kit de extração de DNA comercial regular ou um protocolo padrão similar.

Protocol

1. Coleta de Amostras Coletar amostras de sangue de indivíduos com o consentimento informado adequado. Para cada pessoa, desenhar 4 a 5 ml de sangue para um tubo P100 (BD Diagnostics, Franklin Lake, Nova Iorque, EUA). Para fins de comparação, ao mesmo tempo recolher sangue num tubo contendo EDTA. Os tubos P100 BD contêm 15,8 ml K2EDTA seca por pulverização e um vasto espectro de propriedade liofilizado coquetel de inibidores de protease para impedir a coagulação e estabilizar as proteínas d…

Representative Results

Avaliação da qualidade do DNA e medição da concentração Os rendimentos de P100_DNAs foram significativamente inferiores aos dos EDTA_DNAs (Tabelas 1 e 2). A pureza do ADN representada pelo seu valor de rácio 260/280 é similar para ambos e conjunto de amostras P100_DNA EDTA_DNA (Tabelas 1 e 2). A qualidade do ADN é bastante uniforme dentro de cada conjunto de amostras, embora alguma degradação é visto nas amostras ED…

Discussion

Muitas doenças humanas têm causas genéticas e explorar a base genética da doença humana exige uma crescente DNA de alta qualidade. A fonte mais comum de ADN utilizado em estudos genéticos se sangue total anticoagulado. Porque maioria dos laboratórios clínicos realizar testes bioquímicos, sorológicos e viral como um primeiro passo na investigação da evolução fenotípica, o sangue é muitas vezes coletado em um tubo de plasma. Após a recolha do plasma, o sangue compactado é frequentemente descartados. Port…

Materials

Name of the reagent/equipment	Company	Catalogue number
BD P100 tubes	BD Diagnostics	366448
EDTA tubes	BD Diagnostics	367863
Sucrose	Sigma	S9378
Paper clip	Office product
15 ml tube	Corning	430052
Red blood cells (RBC)	Qiagen	158389 (kit)
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Thermo Scientific	SH30256.01
BioSprint 96 DNA Blood Kit (48)	Qiagen	940054
1.7 ml microtubes	Axygen	MCT-175-C
Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit	Illumina	WG-352-1001
Bead array reader	Illumina	NA
GenomeStudio Software	Illumina	N/A