En praktisk och ny metod att extrahera genomisk DNA från Kits blodinsamling för Plasma Protein Preservation
Summary
Vi beskriver en ny metod för att isolera genomiskt DNA från helblod för plasma / serologi. Efter plasma, är den komprimerade blod brukar kasseras. Vår nya metod innebär en betydande förbättring jämfört med befintliga metoder och gör DNA och plasma tillgängliga från en enda samling, utan att begära ytterligare blod.
Abstract
Laboratorietester kan göras på de cellulära eller flytande delar av blodet. Användningen av olika blodprovsrör bestämmer delen av blodet som kan analyseras (helblod, plasma eller serum). Laboratorier som deltar i att studera den genetiska grunden för mänskliga sjukdomar är beroende av antikoagulerat helblod i EDTA-innehållande vacutainer som källa för DNA för genetisk / genomisk analys. Eftersom de flesta kliniska laboratorier utför biokemiska, serologiska och virala testresultat som ett första steg i fenotypisk utfall undersökningen, antikoagulerat blod också samlats i heparin-innehållande rör (plasma tube). Därför när DNA och plasma behövs för samtidiga och parallella analyser av både genetiska och proteomik data är det brukligt att samla in blod i både EDTA och heparin rör. Om blod skulle kunna samlas i ett enda rör och fungera som en källa för både plasma och DNA, skulle denna metod betraktas som en förbättring av befintliga methods. Användningen av den kompakterade blod efter plasmaextraktion utgör en alternativ källa för genomiskt DNA, vilket minimerar den mängd blod som bearbetade proverna och minska antalet sampel som krävs av varje patient. Detta skulle slutligen spara tid och resurser.
BD P100 bloduppsamlingssystem för plasmaprotein bevarande skapades som en förbättrad metod än tidigare plasma eller serum samling rören 1, för att stabilisera proteinhalten i blodet, vilket möjliggör bättre upptäckt protein biomarkör och proteomik experiment från humant blod. BD P100 rör innehåller 15,8 ml spraytorkad K2EDTA och en lyofiliserad proprietary brett spektrum cocktail av proteasinhibitorer för att förhindra koagulering och stabilisera plasmaproteiner. De har också en mekanisk separator, vilket ger en fysisk barriär mellan plasma och pellets cell efter centrifugering. Få metoder har anvisats för att extrahera DNA från koagulerat blod SAmples samlats i gamla plasma rören 2-4. Utmaningar från dessa metoder var i huvudsak är knuten till typen av separator inuti rören (gel separator) och inkluderade svårighet att återvinna den levrat blod, besväret att fragmentera eller dispergera koaglet, och obstruktion av koagel extraktion genom separationsgelen.
Vi presenterar den första metoden som utvinner och renar genomisk DNA från blod dras i de nya BD P100 rör. Vi jämför kvaliteten på DNA-prov från P100 rören till att från EDTA-rör. Vår strategi är enkel och effektiv. Det handlar om fyra viktiga steg enligt följande: 1) användning av en plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) rör med mekanisk separator för provtagningen, 2) avlägsnande av den mekaniska separatorn använder en kombination av sackaros och en steril gem metallisk krok, 3) separation av lättcellskoncentratskiktet innehållande de vita cellerna och 4) isolering av genom-DNA frånbuffy coat med en vanlig kommersiell kit DNA-extraktion eller liknande standardprotokoll.
Protocol
Representative Results
Discussion
Många mänskliga sjukdomar har genetiska orsaker och utforska den genetiska grunden för mänsklig sjukdom kräver en ökande högkvalitativt DNA. Den vanligaste källan av DNA som används i genetiska studier är antikoagulerat helblod. Eftersom de flesta kliniska laboratorier utför biokemiska, serologiska och virala testresultat som ett första steg i fenotypisk utfall utredning, blodet ofta samlas i en plasma rör. Efter uppsamling av plasma, är det komprimerade blod ofta kasseras. Därför, när DNA behövs för …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number |
| BD P100 tubes | BD Diagnostics | 366448 |
| EDTA tubes | BD Diagnostics | 367863 |
| Sucrose | Sigma | S9378 |
| Paper clip | Office product | |
| 15 ml tube | Corning | 430052 |
| Red blood cells (RBC) | Qiagen | 158389 (kit) |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Thermo Scientific | SH30256.01 |
| BioSprint 96 DNA Blood Kit (48) | Qiagen | 940054 |
| 1.7 ml microtubes | Axygen | MCT-175-C |
| Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit | Illumina | WG-352-1001 |
| Bead array reader | Illumina | NA |
| GenomeStudio Software | Illumina | N/A |
References
- Yi, J., Kim, C., Gelfand, C. A. Inhibition of intrinsic proteolytic activities moderates preanalytical variability and instability of human plasma. Journal of Proteome Research. 6, 1768-1781 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clinical Chemistry. 42, 647-648 (1996).
- Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clinical Chemistry. 44, 1748-1750 (1998).
- Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Molecular Biotechnology. 46, 258-264 (2010).
- Cortes, A., Brown, M. A. Promise and pitfalls of the Immunochip. Arthritis Research & Therapy. 13, 101 (2011).
- Basuni, A. A., Butterworth, L. A., Cooksley, G., Locarnini, S., Carman, W. F. An efficient extraction method from blood clots for studies requiring both host and viral DNA. Journal of Viral Hepatitis. 7, 241-243 (2000).
- Kanai, N., Fujii, T., Saito, K., Tokoyama, T. Rapid and simple method for preparation of genomic DNA from easily obtainable clotted blood. Journal of Clinical Pathology. 47, 1043-1044 (1994).
- Adkins, K. K., Strom, D. A., Jacobson, T. E., Seemann, C. R., O’Brien, D. P., Heath, E. M. Utilizing genomic DNA purified from clotted blood samples for single nucleotide polymorphism genotyping. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 126, 266-270 (2002).
- Siafakas, N., Burnett, L., Bennetts, B., Proos, A. Nonenzymatic extraction of DNA from blood collected into serum separator tubes. Clinical Chemistry. 41, 1045-1046 (1995).
- Everson, R. B., Mass, M. J., Gallagher, J. E., Musser, C., Dalzell, J. Extraction of DNA from cryopreserved clotted human blood. BioTechniques. 15, 18-20 (1993).
- Se Fum Wong, S., Kuei, J. J., Prasad, N., Agonafer, E., Mendoza, G. A., Pemberton, T. J., Patel, P. I. A simple method for DNA isolation from clotted blood extricated rapidly from serum separator tubes. Clin. Chem. 53, 522-524 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clin. Chem. 42, 647-648 (1996).
- Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clin. Chem. 44, 1748-1750 (1998).
- Matheson, L. A., Duong, T. T., Rosenberg, A. M., Yeung, R. S. Assessment of sample collection and storage methods for multicenter immunologic research in children. Journal of Immunological Methods. 339, 82-89 (2008).
- Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Mol. Biotechnol. 46, 258-264 (2010).
- Polychronakos, C. Fine points in mapping autoimmunity. Nature. 43, 1173-1174 (2011).
- Cooper, J. D., Simmonds, M. J., Walker, N. M., Burren, O., Brand, O. J., Guo, H., Wallace, C., Stevens, H., Coleman, G., Franklyn, J. A., Todd, J. A., Gough, S. C. Seven newly identified loci for autoimmune thyroid disease. Human Molecular Genetics. , (2012).
