Den kraniala mesenkym genomgår dramatiska morfogena rörelser som sannolikt ger en drivkraft för förhöjning av de neurala veck<sup> 1,2</sup>. Här beskriver vi en enkel<em> Ex vivo</em> Explantera analys för att karakterisera cellulära beteenden av kraniala mesenkym under neurulation. Denna analys har många tillämpningar, inklusive att bli föremål för farmakologiska manipulationer och levande analyser avbildning.
Det centrala nervsystemet är härledd från den neurala plattan som genomgår en serie komplexa morfogenetiska rörelser resulterar i bildning av det neurala röret i en process som kallas neurulation. Under neurulation är morfogenes av mesenkym bakom det neurala plattan tros driva neurala faldig ökning. Den kraniala mesenkym består av den paraxiella mesoderm och neurala celler crest. Cellerna i den kraniala mesenkym bildar en pourous nätverket som består av stellatceller formade celler och sammanblandning extracellulära matrix (ECM) strängar som stöder de neurala vikningarna. Under neurulation genomgår den kraniala mesenkym stereotypa omarrangemang resulterar i sin expansion och dessa rörelser tros ge en drivkraft för neurala faldig ökning. Dock fortsatt vägar och cellulära beteenden som driver kranial mesenkym morfogenes dåligt undersökta. Interaktioner mellan ECM och cellerna i de kraniala mesenkymceller underliggande These cell beteenden. Här beskriver vi en enkel ex-analys vivo explantat utformats för att karakterisera beteenden hos dessa celler. Denna analys är kan ändras till farmakologiska manipulationer för att dissekera signalvägar involverade och levande analyser bildbehandling för att ytterligare karakterisera beteendet hos dessa celler. Vi presenterar ett representativt experiment som visar användbarheten av denna analys för att karaktärisera de flyttande egenskaperna hos den kraniala mesenkymet på en variation av ECM-komponenter.
Neuralrörsdefekter stängning i Skallparti sker mellan embryonala dag 8,5 (E8.5) och 9,5 i musembryo. Underlåtenhet att korrekt stänga neuralröret i huvudet resulterar i anencefali, en gemensam strukturell missbildning hos människor och är oförenlig med livet. De krafter som driver cefaliska neuralrörsdefekter stängning genereras från både nervvävnad själv och den omgivande epidermis och mesenkym 3. Särskilt expansion av den kraniala mesenkym tros vara väsentlig för förhöjning av den kraniala neurala veck 1,2. Den kraniala mesenkym är rik på ECM-proteiner i synnerhet glykosylerade proteiner såsom heparinsulfat proteoglykaner, kondroitin sulfater och hyaluronat 4-8.
Till skillnad från i kycklingembryo där neurala crest celler emigrera från den dorsala neuralröret efter neuralröret stängning, migrerar den neurallisten i musembryo samtidigt som de neurala vikningarna börjar rIse (efter 5 somit stadiet). Sålunda under neurulation i musembryo, den kraniala mesenkym består av celler härledda från neurallisten och paraxiella mesoderm. Neurallisten och axelparallella populationer mesoderm induceras vid olika tidpunkter i utvecklingen, lokaliserade i olika positioner i embryot och utvecklas till olika strukturer 9,10. Den paraxiella mesoderm härstammar från primitivstrimman och migrerar till den främre regionen av embryot för att ligga den presumtiva neurala plattan. Neurallisten induceras vid korsningen av den neurala plattan och epidermal ektoderm, undergår en epitelial att mesenkym övergång och delamineras just före neurala faldig förhöjning i gnagare embryot. Neurallist celler migrerar längs stereotypa banor i subectodermal paraxiella mesoderm till brankiala bågen, frontonasal och periokulär mesenkym. Den paraxiella mesoderm kommer att bidra till en del av skallben valv och musklerna i ansiktet, medan the neurallisten kommer att bidra till andra ben i skallen och ansiktet förutom kranialnerver 9-11. Den paraxiella mesoderm och neurala linjer crest kan differentiellt präglas av Mesp1-cre och Wnt1-Cre transgena linjer mus respektive 9.
Den väsentliga roll kraniala mesenkym i neuralrörsdefekter förslutningen har framgår av experiment där behandling av gnagare embryon med ECM störa såsom hyaluronidas, kondroitinas ABC, heparitinas eller Diazo-oxo-norleucin (DON) under neurulation nedsatt neuralrörsdefekter stängning 7, 12-14. I dessa experiment visade histologisk analys av statiska delar efter neurulation tillhörande dysmorphogeneis av den kraniala mesenkym 7,12-14. Eftersom den teratogena agenten hade tillgång till flera vävnader, återstår det att bestämmas om den kraniala mesenkym verkligen målvävnaden. Till stöd för slutsatsen att denna vävnadär viktigt för neurulation visas kraniala mesenkym onormala på histologiska analyser i vissa mus mutanter med exencefali 15-17. Fortfarande, i de flesta fall, har effekten av mutationen på den cellulära beteende kraniala mesenkym inte åtgärdats.
Vi har utarbetat en ex-analys vivo explantation att direkt undersöka konsekvensen av genetisk mutation eller farmakologisk manipulation på beteendet hos kraniala mesenkymceller 15. Denna analys liknar det som publicerats av Tzahor et al 2003 för att komma åt differentiering potential kraniala mesenkym som ligger bakom rhombomeres 18 förutom att vi har ändrat explantatet dissektionen att studera flyttande egenskaper mera främre populationer av kranial mesenkym som ligger bakom främre neurala platta. Vår metod är också en modifikation av explantation analyser utförs i kycklingembryo att analysera migrerande beteende neurallisten med key skillnader. Tidigare förberedelser har explanterade neurala krön eller mer bakre axelparallellt mesoderm 19,20. Dessutom, under neurala faldig ökning av kyckling embryot har neurallisten ännu inte emigrerade från den dorsala neuralröret och därmed explantat tagna av den främre axelparallellt mesoderm inte skulle innehålla neurala crest celler. I vår analys, är kraniala mesenkymceller explantat bestående av axelparallellt mesoderm, neurallisten och yta ektoderm framställdes och ströks ut på ett substrat. Experimentell manipulering inklusive isolering av explantat från genetiska mutanter, plätering explantat på olika ECM eller farmakologiska behandlingar kan utföras. Celler migrerar från explantatet och avståndet, antal och beteende kan analyseras och jämföras mellan behandlingsgrupperna. Dessutom är denna beredning kan ändras för analyser av cellulär migrering av levande avbildningstekniker. Efter migreringen experiment kan explantat fixeras och utsättas för immunhistokemiska analyser pälsther belysa effekten av behandlingar. På det hela taget är det protokoll som presenteras här en enkel ex vivo för att undersöka beteendet hos den kraniala mesenkym. Som ett representativt experiment, använder vi denna analys för att undersöka migration av kraniala mesenkym på olika extracellulära substrat.
Den metod som används här är ett kraftfullt analys för att undersöka beteendet hos kraniala mesenkymceller. Utöver de statiska analyser som presenteras här, realtidsundersökningen experiment i ljust fält eller i kombination med uttryck av GFP-märkta proteiner kan användas för att undersöka beteendet hos cellerna i realtid då de migrerar från explantatet. För levande imaging experiment, skulle explantat märkas med Dil eller att differentiera migrering av neurallisten från paraxiella mesodermet, ROSA-YFP, Mesp1-cre eller ROSA-YFP, Wnt1-cre eller andra transgena linjer kan användas. Kraniala mesenkym-ECM interaktioner kan också undersökas med användning denna explantat analys. Här har vi platta explantat på olika ECM substrat som är närvarande i den kraniala mesenkymet att visa att celler migrerar på dessa i olika grad och att ECM påverkar cellernas morfologi. Vidare kan explantat vara inbäddad i en tredimensionell matris för att komma till beteenden av celÄr i detta sammanhang. Denna explantat analys är kan ändras för analys av effekten av genetiska och farmakologiska manipulationer på kraniella mesenkymceller beteenden att analysera inre och yttre ledtrådar som kan reglera och ändra migration. Till exempel använde vi denna analys i våra studier att urskilja rollen av överskott Hsp90 utsöndring i de onormala cellulära beteenden i Hectd1 mutant kranial mesenkym 15. I dessa experiment, behandlade vi explantat med anti-Hsp90-antikropp, Hsp90 protein, geldanamycin och DMA (dimetyl amelioride) för att blockera sekretion av Hsp90 att visa att onormalt beteende av Hectd1 mutanta celler beror på överskott extracellulära Hsp90 15. Liknande tillvägagångssätt kan användas för att farmakologiskt dissekera ytterligare vägar bakom normal eller onormal morfogenes av kraniala mesenkym. När analysen är klar, kan explantat och celler sträckande analyseras genom en mängd metoder. Till exempel, immunohistokemiska analyser cen användas för att undersöka lokalisering av proteiner kritiska för cell rörelser. Transkriptomanalys analyser skulle också kunna användas för att bestämma hur behandlingar påverkar genuttryck.
En betydande begränsning av denna teknik är att det inte modell beteenden i tre dimensioner som de skulle ske in vivo. Ändring av protokollet där explantat är inbäddade i en tredimensionell matris (t.ex. Matrigel) tillsammans med uttryck av fluorescerande protein-märkta cellulära fack kan användas nödvändigt att behandla denna fråga. Även om dessa ändringar utfördes, skulle ytterligare experiment för att korrelera beteenden ses i denna ex vivo-analys med dem in vivo vara nödvändigt. Andra begränsningar inkluderar det stora antalet embryon som krävs för att generera ett tillräckligt antal för att generera statiskt signifikanta data. Viktigast är att dissektionen relativt enkel, kräver det att lära sig.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av R01-HD058629 till IEZ