Modifica Chemoselective delle superfici virali tramite Chimica Click Bioorthogonal
Summary
Particelle di adenovirus sono progettati per contenere l'innaturale azidohomoalanine analogo dell'acido amino o lo zucchero azido<em> O</em>-GlcNAz. Il gruppo azide di ciascuno è legato chemoselectively via "scattano" le reazioni di chimica come mezzo di modifica della superficie virale.
Abstract
La modifica di particelle virali ha ricevuto una quantità significativa di attenzione per il suo potenziale impatto enorme per terapia genica, le applicazioni oncolitici e sviluppo di vaccini. 1,2,3 attuali approcci per modificare le superfici virali, che sono prevalentemente a base genetica, spesso soffrono di attenuazione della produzione di virus, l'infettività e cellulari di trasduzione. 4,5 utilizzando la chimica chemoselective click, abbiamo sviluppato un approccio diretto alternativo che evita questi problemi, pur rimanendo allo stesso tempo estremamente flessibile e accessibile. 1,2
L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare l'efficacia di utilizzare la chimica bioorthogonal click per modificare la superficie di particelle di adenovirus di tipo 5. Questo processo a due fasi può essere utilizzato sia terapeuticamente 1 o analiticamente, 2,6 quanto consente di ligazione chemoselective di molecole targeting, coloranti o altre molecole di interesse su proteinepre-etichettati con tag azide. I tre principali vantaggi di questo metodo sono che (1) etichettatura metabolica dimostra poco o nessun impatto sulla fitness virale, 1,7 (2) una vasta gamma di leganti effettrici può essere utilizzato, e (3) è notevolmente veloce, affidabile e di facile accesso. 1,2,7
Nella prima fase di questo procedimento, le particelle di adenovirus sono prodotti tenendo sia azidohomoalanine (Ah, un surrogato metionina) o zucchero innaturale O-legato N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), entrambi i quali contengono l'azide (N-3) funzionali gruppo. Dopo purificazione dei azide modificati particelle virali, una sonda alchino contenente la parte fluorescente TAMRA è ligato in modo chemoselective alle proteine pre-marcate o glicoproteine. Infine, un SDS-PAGE analisi viene eseguita per dimostrare la legatura successo della sonda sulle proteine del capside virale. Incorporazione Aha è mostrato per etichettare tutti i capside viraleproteine (esone, Penton e fibra), mentre O-GlcNAz risultati incorporazione di etichettatura di Fiber solo.
In questo campo in continua evoluzione, diversi metodi per azide-alchino legatura sono stati sviluppati con successo, ma solo i due che abbiamo trovato per essere più conveniente sono qui dimostrato – strain-promosso azide-alchino cicloaddizione (SPAAC) e rame-catalizzata azide-alchino cicloaddizione (CuAAC) in atmosfera deossigenata.
Protocol
Discussion
Lo sviluppo di reazioni click chemoselective e bioorthogonal, compresi quelli di azidi, è un settore in rapida evoluzione della ricerca, e successivamente vi è un numero crescente di queste reazioni da scegliere per le applicazioni bioconiugazione. Abbiamo ristretto il campo di applicazione di questo protocollo per includere solo due metodi che sono stati scelti per la loro utilità nel nostro laboratorio proprio e la disponibilità commerciale di tutti i reagenti.
Nel primo percorso tale …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo riconoscere la NSF per il finanziamento (cbet-0846259).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene | BCBC | 391 |
| Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells | ATCC | CRL-1573 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Invitrogen | 11965-092 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose | Invitrogen | 21013-024 |
| Bovine Calf Serum | Invitrogen | 16170-078 |
| Penicillin – Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10×) | Invitrogen | 15400-054 |
| 100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene | BD Falcon | 353003 |
| Cell culture CO2 incubator | ||
| Hemocytometer | ||
| Biosafety cabinet | ||
| Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe) |
| Avanti J-E centrifuge | Beckman Coulter | 369001 |
| Conical tubes (50 ml, sterile) | BD Falcon | 352098 |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 |
| Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor | Beckman | |
| Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | 5418 |
| Centri-Sep gel filtration spin columns | Princeton Separations | CS-901 |
| Sterile needle, 18 gauge | ||
| Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed) | ||
| Dewar flask | ||
| Liquid nitrogen | ||
| Electrophoresis cell | ||
| Fluorescent gel scanner | ||
| Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1105 |
| L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 |
| Jena Biosciences | CLK-AA005 | |
| Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) | Invitrogen | C33365 |
| Thermo Scientific | 88905 | |
| Sigma-Aldrich | A7480 | |
| Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt | MP Biomedicals | 0215011201 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ||
| Methanol | ||
| Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) | ||
| Disodium Phosphate (Na2HPO4) | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | ||
| 1M HCl | ||
| Glycerol | ||
| Bovine Serum Albumin | ||
| L-cysteine | ||
| L-methionine | ||
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | ||
| 2-mercaptoethanol | ||
| Glycine | ||
| Bromophenol blue | ||
| Cesium Chloride (CsCl) | ||
| Copper(I) Bromide (CuBr) | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | ||
| Potassium Chloride (KCl) | ||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | ||
| Sodium Chloride (NaCl) | ||
| Alkyne probe for CuAAC* | ||
| TAMRA Alkyne | Invitrogen | T10183 |
| Strained alkyne probe for SPAAC* | ||
| TAMRA DIBO Alkyne | Invitrogen | C10410 |
* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors’ catalogs.
References
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