JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Protocol
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

استخدام LysoTracker لكشف موت الخلية المبرمج في الأجنة والخلايا الجذعية الجنينية التفريق

Published: October 11, 2012
doi:
10.3791/4254
, ,
1Eli and Edythe Broad Center for Regenerative Medicine and Stem Cell Research, Keck School of Medicine,University of Southern California

Summary

نقدم بروتوكول بسيط لتصور مناطق موت الخلايا المبرمج (PCD) في أجنة الفئران الجنينية والتمييز الثقافات الخلايا الجذعية (ES) باستخدام صبغة قابلة للذوبان للغاية ودعا LysoTracker.

Abstract

موت الخلية المبرمج (PCD) ويحدث في الكبار للحفاظ على التوازن الطبيعي الأنسجة الجنينية والتنمية خلال لتشكيل الأنسجة والأعضاء 1،2،6،7. خلال التنمية، يمكن أن المواد الكيميائية السامة أو تغيرات جينية تسبب زيادة في PCD PCD أو تغيير الأنماط مما أدى إلى تشوهات النمو والعيوب الخلقية 3-5. لفهم مسببات هذه العيوب، يمكن أن تستكمل دراسة الأجنة في المقايسات مع المختبر التي تستخدم التفريق الجذعية الجنينية (ES) الخلايا.

موت الخلايا المبرمج هو شكل مدروسة من PCD التي تنطوي على حد سواء الذاتية وخارجي مما يشير إلى تفعيل تتالي كاسباس الانزيم. التغييرات الخلية مميزة تشمل blebbing الغشاء، وتقلص النووية، وتجزئة الحمض النووي. أشكال أخرى من PCD لا تنطوي على تفعيل كاسباس وربما تكون النتيجة النهائية من الالتهام الذاتي لفترات طويلة. بغض النظر عن المسار PCD، الخلايا الميتة تحتاج إلى إزالة. في البالغين، والخلايا المناعية PERFORM هذه الوظيفة، بينما في الأجنة، حيث لم الجهاز المناعي تطور بعد، وإزالة يحدث من قبل آلية بديلة. هذه الآلية تنطوي على الخلايا المجاورة (وتسمى "غير المهنية البالعات") أخذ على أكلة الدور يعترفون 'أكل لي' إشارة على سطح الخلية الموت وتبتلع من 8-10. بعد الإحاطة، يتم جلب الحطام إلى يحلول للتدهور. بغض النظر بالتالي آلية PCD، يمكن يرتبط زيادة في النشاط الليزوزومية مع زيادة موت الخلايا.

يمكن لدراسة PCD، وهو فحص بسيط لتصور الجسيمات الحالة في الأنسجة سميكة ومتعدد الطبقات الثقافات يكون من المفيد التمييز. صبغ LysoTracker هو جزيء صغير جدا للذوبان التي يتم الاحتفاظ بها في حجرات التحت خلوية الحمضية مثل يحلول 11-13. يتم أخذ صبغة بنسبة نشرها من خلال والدورة الدموية. منذ اختراق ليست عائقا، والتصور من PCD في الأنسجة سميكة والثقافات متعددة الطبقات من الممكن 12،13 </سوب>. في المقابل، ويقتصر TUNEL (الطرفية deoxynucleotidyl ترانسفيراز نهاية نيك dUTP التوسيم) تحليل 14، إلى عينات صغيرة، المقاطع النسيجية، والثقافات أحادي الطبقة لأن الإجراء يتطلب إدخال / نفاذية محطة ترانسفيراز.

وعلى النقيض من الزرقاء الأنيلين، الذي ينشر ويذوب من المذيبات، LysoTracker الأحمر DND-99 هو قابل للتثبيت، ومشرق، ومستقرة. يمكن تلطيخ يمكن تصور المجهر الفلورسنت القياسية مع مبائر أو في جبل لكليا أو القسم أو باستخدام المذيبات المائية القائمة على وسائل الإعلام تصاعد 12،13. نحن هنا وصف البروتوكولات باستخدام هذه الصبغة للنظر في PCD في الحالات العادية والماوس سونيك القنفذ الأجنة فارغة. وبالإضافة إلى ذلك، علينا أن نبرهن تحليل PCD في التفريق مزارع الخلايا ES وتقديم طريقة بسيطة الكمي. وباختصار، يمكن تلطيخ LysoTracker يكون تكملة كبيرة إلى أساليب أخرى للكشف عن PCD.

Protocol

1. تلوين LysoTracker من أجنة الفئران توليد أجنة الفئران عن طريق وضع الشباب (5-6 الاسبوع القديمة) الإناث في أقفاص مسمار الذكور. حدث صباح رصد التالية لظهور المكونات المهبلية تشير إلى أن التزاوج. إذا الأنثى وهي حامل، ويسمى الظهر …

Discussion

بصمات هامة من موت الخلايا المبرمج وتشمل الكشف عن الحمض النووي من التلف مع مقايسة TUNEL، جنبا إلى جنب مع الكشف عن النشاط كاسباس (الكشف عن MABS أو مع جزيء ملزمة مثل ZVAD-ماركا)، ومراقبة التغيرات الخلوية، وطريقة عرض فسفاتيديل (PS ) على سطح الغشاء (الكشف عنها بواسطة Annexin V ملزمة). هن…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر أعضاء المختبر للحصول على مساعدة مارياني تحرير البروتوكول. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل على منحة ما بعد الدكتوراه التدريب CIRM (JLF)، والتدريب الجسور CIRM (TZTT)، وروبرت E. ومايو R. رايت في مؤسسة (FVM)، وجامعة جنوب كاليفورنيا (FVM).

Materials

Name of the reagent Company   Catalogue number
LysoTracker Red DND-99 Invitrogen #L-7528  
Hanks BSS Invitrogen 14025-076  
Paraformaldehyde EMD EM-PX0055-3  
Vectashield VECTOR H-1200  
DMEM Cellgro 10-013-CV  
Non-essential amino acids Cellgro 25-025-CI  
Sodium pyruvate Cellgro 25-000-CI  
FBS Hyclone SH30071.02  
Pen-Strep Invitrogen 15140-122  
b-Mercaptoethanol, 50 mM Invitrogen 21985-023  
LabTek-II Chamber slides
(8-well)		 Nalge Nunc International 154534  
0.1% Gelatin Millipore ES-006-B  
Dulbecco’s PBS (D-PBS) Cellgro 21-031-CV  
     

Solution Recipes

4% Paraformaldehyde

For 100 ml:

  1. Mix 4 g paraformaldehyde, 90 ml H2O, and NaOH (a drop of 2N NaOH). The paraformaldehyde will not go into solution until you have added some NaOH to increase the pH.
  2. Stir and heat at 60 °C until all the powder is in solution (~10-20 min). Do not overheat.
  3. Add ~10 ml 10x PBS to achieve a final volume of 100 ml.
  4. Store at -20 °C in convenient (~10 ml or ~40 ml) aliquots.

WARNING: Paraformaldehyde in ‘frill’ form (compressed small pellets) is less powdery and can therefore be measured outside of a hood. However you should still wear a protective dust mask (N95 at least) during handling.

EB Culture Media

For 500 ml EB Media:

DMEM: 404.5 ml
FBS: 75.0 ml
L-Glutamine: 5.0 ml
Penicillin/Streptomycin: 5.0 ml
Non-essential amino acids: 5.0 ml
Sodium pyruvate: 5.0 ml
β-Mercaptoethanol: 500 μl
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baehrecke, E. H. How death shapes life during development. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 779-787 (2002).
  2. Meier, P., Finch, A., Evan, G. Apoptosis in development. Nature. 407, 796-801 (2000).
  3. Ikonomidou, C. Ethanol-induced apoptotic neurodegeneration and fetal alcohol syndrome. Science. 287, 1056-1060 (2000).
  4. Dunty, W. C., Chen, S. Y., Zucker, R. M., Dehart, D. B., Sulik, K. K. Selective vulnerability of embryonic cell populations to ethanol-induced apoptosis: implications for alcohol-related birth defects and neurodevelopmental disorder. Alcohol Clin. Exp. Res. 25, 1523-1535 (2001).
  5. Price, O. T., Lau, C., Zucker, R. M. Quantitative fluorescence of 5-FU-treated fetal rat limbs using confocal laser scanning microscopy and Lysotracker. Cytometry A. 53, 9-21 (2003).
  6. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  7. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  8. Qu, X. Autophagy gene-dependent clearance of apoptotic cells during embryonic development. Cell. 128, 931-946 (2007).
  9. Grimsley, C., Ravichandran, K. S. Cues for apoptotic cell engulfment: eat-me, don’t eat-me and come-get-me signals. Trends Cell Biol. 13, 648-656 (2003).
  10. Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).
  11. Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release. Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).
  12. Zucker, R. M., Hunter, S., Rogers, J. M. Confocal laser scanning microscopy of apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos. Cytometry. 33, 348-354 (1998).
  13. Zucker, R. M., Hunter, E. S., Rogers, J. M. Apoptosis and morphology in mouse embryos by confocal laser scanning microscopy. Methods. 18, 473-480 (1999).
  14. Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 119, 493-501 (1992).
  15. Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
  16. Chiang, C. Manifestation of the limb prepattern: limb development in the absence of sonic hedgehog function. Dev. Biol. 236, 421-435 (2001).
  17. Ishibashi, M., McMahon, A. P. A sonic hedgehog-dependent signaling relay regulates growth of diencephalic and mesencephalic primordia in the early mouse embryo. Development. 129, 4807-4819 (2002).
  18. Schuldiner, M. Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Brain Res. 913, 201-205 (2001).
  19. Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
  20. Dumont, A. Hydrogen peroxide-induced apoptosis is CD95-independent, requires the release of mitochondria-derived reactive oxygen species and the activation of NF-kappaB. Oncogene. 18, 747-757 (1999).
  21. Hampton, M. B., Orrenius, S. Dual regulation of caspase activity by hydrogen peroxide: implications for apoptosis. FEBS Lett. 414, 552-556 (1997).
  22. Wood, W. Mesenchymal cells engulf and clear apoptotic footplate cells in macrophageless PU.1 null mouse embryos. Development. 127, 5245-5252 (2000).
  23. Scott, R. C., Juhasz, G., Neufeld, T. P. Direct induction of autophagy by Atg1 inhibits cell growth and induces apoptotic cell death. Curr. Biol. 17, 1-11 (2007).
  24. Rodriguez-Enriquez, S., Kim, I., Currin, R. T., Lemasters, J. J. Tracker dyes to probe mitochondrial autophagy (mitophagy) in rat hepatocytes. Autophagy. 2, 39-46 (2006).
  25. Bampton, E. T., Goemans, C. G., Niranjan, D., Mizushima, N., Tolkovsky, A. M. The dynamics of autophagy visualized in live cells: from autophagosome formation to fusion with endo/lysosomes. Autophagy. 1, 23-36 (2005).
  26. Boya, P., Mellen, M. A., de la Rosa, E. J. How autophagy is related to programmed cell death during the development of the nervous system. Biochem. Soc. Trans. 36, 813-817 (2008).
  27. Galluzzi, L. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).
  28. Klionsky, D. J. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes. Autophagy. 4, 151-175 (2008).

Tags

LysoTrackerProgrammed Cell DeathPCDEmbryosDifferentiating Embryonic Stem CellsApoptosisCaspase Enzyme CascadeMembrane BlebbingNuclear ShrinkingDNA FragmentationAutophagyImmune CellsNon-professional PhagocytesLysosomal Activity
check_url/fr/4254?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Fogel, J. L., Thein, T. Z. T., Mariani, F. V. Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (68), e4254, doi:10.3791/4254 (2012).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image