使用LysoTracker检测及鉴别胚胎干细胞在胚胎细胞程序性死亡

Summary

我们提出了一个简单的协议，可视化地区的小鼠胚胎中的细胞程序性死亡（PCD）和鉴别胚胎干（ES）细胞培养，使用高度水溶性染料LysoTracker。

Abstract

程序性细胞死亡（PCD）发生于成人，以维持正常组织稳态和胚胎发育过程中形成组织和器官^1,2,6,7。在开发过程中，有毒化学物质或基因的改变可以导致PCD增加或改变PCD的模式，导致发育异常和出生缺陷^3-5。要了解这些缺陷的病因学，胚胎的研究，使用区分胚胎干细胞（ES细胞） 在体外实验中，可以补充。

细胞凋亡是一种形式的PCD研究，既包括内在的和外在的信号，激活半胱天冬酶的酶级联。细胞特性的变化包括膜皱缩，核收缩，且DNA碎片。不涉及其他形式的PCD半胱天冬酶的激活，最终的结果可能是长期自噬。无论PCD的途径，死亡的细胞需要被删除。在成年人中，免疫细胞PERFORM功能，而在胚胎的免疫系统尚未开发，拆除产生的一种替代机制。这种机制涉及到邻近的细胞（称为“非专业吞噬细胞”），吞噬作用，他们认识到表面上的死细胞和吞噬^8-10“吃我”的信号。吞噬后，碎片带来的溶酶体降解。因此无论PCD机制，溶酶体活性的增加可以增加细胞死亡相关。

要学习PCD，一个简单的分析，可视化厚的组织和多层区分文化的溶酶体中是有用的。 LysoTracker染料是一种高度可溶性小分子，被保持在如酸性亚细胞溶酶体^11-13。的染料是采取了通过扩散和通过循环。由于是不是一个障碍，可视化的PCD在厚厚的组织和多层次的文化渗透是可能的^12,13 </支持>。与此相反，TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶缺口末端标记法）分析^14，仅限于小样本，组织切片和单层培养，因为此过程需要进入/渗透终端转移。

相反，扩散和溶解的溶剂苯胺蓝，DND-99 LysoTracker红，是可以解决的，明亮的，稳定的。染色可以可视化与标准荧光或共聚焦显微镜在整个贴装或部分，使用水性或溶剂型的安装媒体^12,13。在这里，我们描述了使用此染料看，PCD在正常和 Sonic Hedgehog null小鼠胚胎的协议。此外，我们表现出ES细胞培养鉴别分析PCD，并提出一个简单的量化方法。总之，LysoTracker染色检测PCD的其他方法可以是一个很好的补充。

Protocol

1。 LysoTracker染小鼠胚胎生成的小鼠胚胎放置年轻女性到男性螺柱笼（5-6周龄）。监视以下早晨指示，交配阴道栓的外观发生。如果女性怀孕了，中午在这一天被称为0.5 DPC（天交配后）。这里介绍的是该程序的胚胎7-13 DPC的理想选择。 在胚胎的利益，根据经批准的协议和安乐死的女性，切除子宫。从一个10厘米的培养皿中，用Hanks，BSS（无酚红）的蜕膜中取出胚胎。删除多余的胚胎?…

Discussion

细胞凋亡的重要标志包括与TUNEL检测的DNA损伤的检测，沿与caspase活性的检测（检测的单克隆抗体或结合分子如ZVAD-芬兰马克），观察细胞的变化，和介绍的磷脂酰丝氨酸（PS ）在膜表面上（Annexin V结合）中检测到的。与每个这些检测方法也有一些缺点。例如，TUNEL法检测中使用的末端转移不穿透超越几个细胞层。膜联蛋白V可以标记细胞不进行细胞凋亡，如那些具有的膜破坏，（膜联蛋白V得到在细?…

Materials

Name of the reagent	Company		Catalogue number
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	#L-7528
Hanks BSS	Invitrogen	14025-076
Paraformaldehyde	EMD	EM-PX0055-3
Vectashield	VECTOR	H-1200
DMEM	Cellgro	10-013-CV
Non-essential amino acids	Cellgro	25-025-CI
Sodium pyruvate	Cellgro	25-000-CI
FBS	Hyclone	SH30071.02
Pen-Strep	Invitrogen	15140-122
b-Mercaptoethanol, 50 mM	Invitrogen	21985-023
LabTek-II Chamber slides (8-well)	Nalge Nunc International	154534
0.1% Gelatin	Millipore	ES-006-B
Dulbecco’s PBS (D-PBS)	Cellgro	21-031-CV
			Solution Recipes 4% Paraformaldehyde For 100 ml: Mix 4 g paraformaldehyde, 90 ml H2O, and NaOH (a drop of 2N NaOH). The paraformaldehyde will not go into solution until you have added some NaOH to increase the pH. Stir and heat at 60 °C until all the powder is in solution (~10-20 min). Do not overheat. Add ~10 ml 10x PBS to achieve a final volume of 100 ml. Store at -20 °C in convenient (~10 ml or ~40 ml) aliquots. WARNING: Paraformaldehyde in ‘frill’ form (compressed small pellets) is less powdery and can therefore be measured outside of a hood. However you should still wear a protective dust mask (N95 at least) during handling. EB Culture Media For 500 ml EB Media: DMEM: 404.5 ml FBS: 75.0 ml L-Glutamine: 5.0 ml Penicillin/Streptomycin: 5.0 ml Non-essential amino acids: 5.0 ml Sodium pyruvate: 5.0 ml β-Mercaptoethanol: 500 μl