Wij presenteren een eenvoudig protocol om gebieden van geprogrammeerde celdood (PCD) in muizenembryo's en onderscheidende embryonale stamcellen (ES) celkweken met een sterk oplosbare kleurstof genoemd LysoTracker visualiseren.
Geprogrammeerde celdood (PCD) voor bij volwassenen met normaal weefsel homeostase en tijdens embryonale ontwikkeling aan weefsels en organen 1,2,6,7 vorm. Tijdens de ontwikkeling kan giftige chemicaliën of genetische veranderingen veroorzaken een toename van de PCD of wijzigen PCD patronen resulteert in ontwikkelings-afwijkingen en aangeboren afwijkingen 3-5. De etiologie van deze gebreken begrijpen, kunnen de studie van embryo's aangevuld met in vitro assays die gebruik differentiëren embryonale stamcellen (ES) cellen.
Apoptose is een goed bestudeerde vorm van PCD dat zowel intrinsieke en extrinsieke signalering naar de caspase enzym cascade activeren omvat. Kenmerkend cel veranderingen omvatten membraan blaarachtig, nucleaire krimpen, en DNA-fragmentatie. Andere vormen van PCD niet betrokken caspase activiteit en kan het eindresultaat van langdurige autofagie. Ongeacht de route PCD, stervende cellen moeten worden verwijderd. Bij volwassenen zijn de immuuncellen perfOrm deze functie, terwijl embryo, waar het immuunsysteem nog niet ontwikkeld verwijdering gebeurt door een alternatief mechanisme. Het mechanisme omvat naburige cellen (de zogenaamde "niet-professionele fagocyten") het nemen van een fagocytische rol, ze herkennen het signaal 'ik eet' op het oppervlak van de stervende cel en overspoelen het 8-10. Na afblazen, wordt het puin gebracht naar het lysosoom voor degradatie. Dus ongeacht PCD mechanisme, kan een toename van lysosomale activiteit gecorreleerd met verhoogde celdood.
Om PCD, een eenvoudige test om te lysosomen in dikke weefsels en multilayer differentiëren culturen visualiseren studeren kan nuttig zijn. LysoTracker kleurstof is een sterk oplosbare klein molecuul dat wordt vastgehouden in zure subcellulaire compartimenten zoals het lysosoom 11-13. De kleurstof wordt door diffusie en door de circulatie. Omdat penetratie is niet een belemmering, visualisatie van PCD in dikke weefsels en multi-layer culturen is mogelijk 12,13 </sup>. Daarentegen wordt TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) analyse 14 tot kleine monsters, coupes en monolaagkweken omdat de procedure is de invoer / permeabiliteit van een terminal transferase.
In tegenstelling tot Aniline blauw, die verspreidt en wordt opgelost door oplosmiddelen, LysoTracker Red DND-99 is Muur, helder en stabiel. Kleuring kan zichtbaar worden gemaakt met standaard TL-of confocale microscopie in whole-mount of sectie met behulp van water of oplosmiddelen op basis van montage media 12,13. Hier beschrijven we protocollen het gebruik van deze kleurstof te kijken naar PCD in normale en sonic hedgehog null muis embryo's. Daarnaast tonen we analyse van PCD in differentiëren ES celkweken zijn en een eenvoudige kwantificering methode. Samenvattend kan LysoTracker vlekken zijn een geweldige aanvulling op andere methoden voor het opsporen PCD.
Belangrijke kenmerken van apoptose omvatten de detectie van DNA schade met de TUNEL assay, samen met de detectie van caspase activiteit (gedetecteerd met mAbs of een bindend molecuul zoals zVAD-fmk) de waarneming van cellulaire veranderingen, en de presentatie van fosfatidylserine (PS ) op het membraanoppervlak (gedetecteerd door Annexine V binding). Er zijn enkele nadelen met elk van deze assays. Bijvoorbeeld, de terminal transferase in de TUNEL assay niet doordringen dan een paar cellagen. Annexine V kan ook markeren …
The authors have nothing to disclose.
Wij danken de leden van de Mariani lab om hulp te bewerken het protocol. Dit werk werd gefinancierd door een CIRM Postdoctoraal Training Grant (JLF), een CIRM BRUGGEN stage (TZTT), de Robert E. en mei R. Wright Foundation (FVM), en de Universiteit van Zuid-Californië (FVM).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | |||||||||||||||
LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | #L-7528 | |||||||||||||||
Hanks BSS | Invitrogen | 14025-076 | |||||||||||||||
Paraformaldehyde | EMD | EM-PX0055-3 | |||||||||||||||
Vectashield | VECTOR | H-1200 | |||||||||||||||
DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |||||||||||||||
Non-essential amino acids | Cellgro | 25-025-CI | |||||||||||||||
Sodium pyruvate | Cellgro | 25-000-CI | |||||||||||||||
FBS | Hyclone | SH30071.02 | |||||||||||||||
Pen-Strep | Invitrogen | 15140-122 | |||||||||||||||
b-Mercaptoethanol, 50 mM | Invitrogen | 21985-023 | |||||||||||||||
LabTek-II Chamber slides (8-well) |
Nalge Nunc International | 154534 | |||||||||||||||
0.1% Gelatin | Millipore | ES-006-B | |||||||||||||||
Dulbecco’s PBS (D-PBS) | Cellgro | 21-031-CV | |||||||||||||||
Solution Recipes 4% Paraformaldehyde For 100 ml:
WARNING: Paraformaldehyde in ‘frill’ form (compressed small pellets) is less powdery and can therefore be measured outside of a hood. However you should still wear a protective dust mask (N95 at least) during handling. EB Culture Media For 500 ml EB Media:
|