L'utilisation de Lysotracker pour détecter la mort cellulaire programmée dans les embryons et la différenciation des cellules souches embryonnaires

Summary

Nous présentons un protocole simple de visualiser les régions de la mort cellulaire programmée (PCD) dans des embryons de souris et la différenciation de cellules souches embryonnaires cultures (ES) en utilisant un colorant hautement soluble appelée Lysotracker.

Abstract

La mort cellulaire programmée (PCD) survient chez les adultes pour maintenir l'homéostasie des tissus normaux et au cours du développement embryologique de façonner les tissus et organes ^1,2,6,7. Au cours du développement, les produits chimiques toxiques ou des altérations génétiques peuvent entraîner une augmentation des PCD ou modifier les modes de CPD entraînant des anomalies du développement et des malformations congénitales ^3-5. Pour comprendre l'étiologie de ces défauts, l'étude des embryons peut être complété par des tests in vitro qui utilisent différencier souches embryonnaires (ES) cellules.

L'apoptose est une forme bien étudiée de la CPD qui implique à la fois intrinsèque et extrinsèque de signalisation pour activer la cascade enzyme caspase. Modifications cellulaires caractéristiques comprennent bourgeonnement de la membrane, rétrécissement nucléaire et fragmentation de l'ADN. D'autres formes de PCD ne comportent pas l'activation des caspases et peut être le résultat final de l'autophagie prolongée. Quelle que soit la voie PCD, les cellules mourantes doivent être enlevés. Chez l'adulte, les cellules immunitaires perform cette fonction, tandis que chez les embryons, où le système immunitaire n'a pas encore développé, l'élimination se fait par un autre mécanisme. Ce mécanisme implique les cellules voisines (appelés «non-professionnels» phagocytes) prennent une phagocytaire rôle qu'ils reconnaissent la "eat me" signal sur la surface de la cellule mourante et engloutir ^l'8-10. Après l'engloutissement, les débris est amené vers le lysosome de la dégradation. Ainsi, indépendamment du mécanisme de PCD, une augmentation de l'activité lysosomale peut être corrélée avec la mort cellulaire accrue.

Pour étudier PCD, un test simple de visualiser les lysosomes des tissus épais et multicouches cultures de différenciation peut être utile. Lysotracker colorant est une molécule très soluble petit qui est retenu dans des compartiments subcellulaires acides tels que ^l'11-13 lysosome. Le colorant est absorbé par diffusion et par la circulation. Depuis la pénétration n'est pas un obstacle, la visualisation de la CPD dans les tissus épais et multicouches cultures est possible ^12,13 </sup>. En revanche, TUNEL (terminal désoxynucléotidyltransférase étiquetage dUTP fin nick) analyse ^14, est limitée à de petits échantillons, coupes histologiques et des cultures monocouches parce que la procédure nécessite l'entrée / la perméabilité d'un terminal transférase.

Contrairement aux Bleu d'aniline, qui diffuse et est dissous par des solvants, Lysotracker Rouge MDN-99 est réparable, lumineux et stable. La coloration peut être visualisé par microscopie confocale fluorescente ou standard dans l'ensemble du montage ou de l'article à l'aide aqueux ou à base de solvant milieux de montage ^12,13. Ici, nous décrivons les protocoles utilisant ce colorant à regarder la CPD dans des conditions normales et sonores embryons de souris hérisson nulles. En outre, nous démontrons l'analyse de la CPD dans la différenciation des cultures de cellules ES et de présenter une méthode de quantification simple. En résumé, la coloration Lysotracker peut être un excellent complément à d'autres méthodes de détection de la CPD.

Protocol

1. Coloration Lysotracker des embryons de souris Générer des embryons de souris en plaçant les jeunes (5-6 semaines) femelles dans des cages goujons mâles. Surveiller les matins suivants pour l'apparition d'un bouchon vaginal indiquant que l'accouplement a eu lieu. Si la femelle est enceinte, à midi ce jour-là est appelé 0,5 dpc (coït jours après). La procédure présentée ici est idéal pour les embryons 13.7 dpc. Le jour embryonnaire d'intérêt, euthanasier de la femelle…

Discussion

Caractéristiques importantes de l'apoptose comprennent la détection de lésions de l'ADN avec le test TUNEL, ainsi que la détection de l'activité des caspases (détectée par anticorps monoclonaux ou une molécule de liaison tels que ZVAD-fmk), l'observation des changements cellulaires, et la présentation de la phosphatidylsérine (PS ) sur la surface de la membrane (détecté par l'annexine V liaison). Il ya quelques inconvénients à chacune de ces épreuves. Par exemple, le terminal transfér…

Materials

Name of the reagent	Company		Catalogue number
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	#L-7528
Hanks BSS	Invitrogen	14025-076
Paraformaldehyde	EMD	EM-PX0055-3
Vectashield	VECTOR	H-1200
DMEM	Cellgro	10-013-CV
Non-essential amino acids	Cellgro	25-025-CI
Sodium pyruvate	Cellgro	25-000-CI
FBS	Hyclone	SH30071.02
Pen-Strep	Invitrogen	15140-122
b-Mercaptoethanol, 50 mM	Invitrogen	21985-023
LabTek-II Chamber slides (8-well)	Nalge Nunc International	154534
0.1% Gelatin	Millipore	ES-006-B
Dulbecco’s PBS (D-PBS)	Cellgro	21-031-CV
			Solution Recipes 4% Paraformaldehyde For 100 ml: Mix 4 g paraformaldehyde, 90 ml H2O, and NaOH (a drop of 2N NaOH). The paraformaldehyde will not go into solution until you have added some NaOH to increase the pH. Stir and heat at 60 °C until all the powder is in solution (~10-20 min). Do not overheat. Add ~10 ml 10x PBS to achieve a final volume of 100 ml. Store at -20 °C in convenient (~10 ml or ~40 ml) aliquots. WARNING: Paraformaldehyde in ‘frill’ form (compressed small pellets) is less powdery and can therefore be measured outside of a hood. However you should still wear a protective dust mask (N95 at least) during handling. EB Culture Media For 500 ml EB Media: DMEM: 404.5 ml FBS: 75.0 ml L-Glutamine: 5.0 ml Penicillin/Streptomycin: 5.0 ml Non-essential amino acids: 5.0 ml Sodium pyruvate: 5.0 ml β-Mercaptoethanol: 500 μl