की तैयारी<em> ड्रोसोफिला</em> के लिए केन्द्रीय न्यूरॉन्स<em> स्वस्थानी में</em> पैच clamping
Summary
स्वस्थानी पैच में क्लैंप रिकॉर्डिंग बरकरार circuitry में न्यूरॉन्स की electrophysiological लक्षण वर्णन के लिए किया जाता है. ड्रोसोफिला आनुवंशिक मॉडल पैच clamping में मुश्किल है क्योंकि CNS छोटे और एक मजबूत म्यान से घिरा हुआ है. इस अनुच्छेद के बाद पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए म्यान और स्वच्छ न्यूरॉन्स को दूर करने के लिए प्रक्रिया का वर्णन करता है.
Abstract
लघु पीढ़ी समय और सतही आनुवंशिक तकनीक फल मक्खी ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर मौलिक तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान के क्षेत्र में एक उत्कृष्ट आनुवंशिक मॉडल बनाने के. आयन चैनलों सभी व्यवहार के आधार पर कर रहे हैं क्योंकि वे neuronal excitability मध्यस्थता. 1 वोल्टेज gated आयन क्लोन चैनल ड्रोसोफिला वोल्टेज gated पोटेशियम चैनल 1,2 शेखर था. यह तंत्रिका तंत्र समारोह के लिए आयन चैनलों और झिल्ली excitability की भूमिका को समझने की ओर ड्रोसोफिला में शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरण उपलब्ध स्वस्थानी पैच दबाना रिकॉर्डिंग के साथ गठबंधन करने के लिए उपयोगी है. कई सालों के लिए ऐसी रिकॉर्डिंग ड्रोसोफिला सीएनएस के छोटे आकार के द्वारा बाधा उत्पन्न की. इसके अलावा, एक मजबूत glia और कोलेजन से बना म्यान पैच विंदुक केंद्रीय न्यूरॉन्स को उपयोग के लिए बाधाओं का गठन किया है. इस म्यान हटाने के वयस्क ड्रोसोफिला CNS में किसी भी न्यूरॉन से एक पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक पूर्व शर्त है. हाल के वर्षों मेंवैज्ञानिकों स्वस्थानी पैच दबाना रिकॉर्डिंग में 3,4 वयस्क मस्तिष्क और भ्रूण 5,6, 7,8,9,10, लार्वा, और वयस्क 11,12,13,14 ड्रोसोफिला के उदर तंत्रिका कॉर्ड में न्यूरॉन्स से संचालन करने में सक्षम हो गया है. एक स्थिर giga मुहर एक अच्छा पैच के लिए पूर्व शर्त है और कोशिका झिल्ली रिसाव धाराओं से बचने के साथ पैच विंदुक की साफ संपर्क पर निर्भर करता है. इसलिए, वयस्क ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स से यथास्थल पैच दबाना रिकॉर्डिंग में पूरे सेल के लिए अच्छी तरह से साफ किया जाना चाहिए. पहले चरण में, ganglionic म्यान enzymatically इलाज किया जा है और यंत्रवत् लक्ष्य कोशिकाओं को सुलभ बनाने के लिए हटा दिया है. दूसरे चरण में, कोशिका झिल्ली को पॉलिश किया जा है कि glia कोलेजन, या अन्य सामग्री का कोई परत giga मुहर गठन में खलल पड़ सकता है. यह लेख बताता है कि कैसे ड्रोसोफिला उदरीय तंत्रिका कॉर्ड, उड़ान 5 motoneuron (15 MN5), दैहिक पूरे ग के लिए तैयार करने के लिए एक की पहचान केंद्रीय न्यूरॉनपक्ष पैच दबाना रिकॉर्डिंग. और न्यूरॉन पहचान दृश्यता MN5 में GFP की लक्षित अभिव्यक्ति द्वारा हासिल की है. हम स्वयं पैच दबाना तकनीक की व्याख्या करने के लिए लक्ष्य नहीं है.
Protocol
Discussion
GFP जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ कोशिकाओं visualizing, यह महत्वपूर्ण है कि बहुत ज्यादा प्रकाश नहीं तैयारी पर बेनकाब. यह तस्वीर नुकसान में हो सकता है. हम रोशनी के लिए 100W एचबीओ कम चाप पारा बल्ब का उपयोग करते हैं, औ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Agent/item | Company | Catalog number |
| Protease type XIV | Sigma Aldrich USA | P5147 |
| Microfil flexible injection needle | World Precision Instruments USA | MF28G-5 |
| Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament | World Precision Instruments USA | PG52151-4 |
| DiI | Invitrogen USA | D3899 |
| Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT |
| ND filter set (unmounted) | Chroma | 22000b series |
| Electrode holder 1-HL-U | Molecular Devices | 1-HL-U |
References
- Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Tempel, B. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Cloning of genomic and complementary DNA from Shaker, a putative potassium channel gene from Drosophila. Science. 237, 749-753 (1987).
- Tempel, B. L., Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Sequence of a probable potassium channel component encoded at Shaker locus of Drosophila. Science. 237, 770-775 (1987).
- Gu, H., O’Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J. Vis. Exp. (6), e248 (2007).
- Gu, H., Jiang, S. A., Campusano, J. M., Iniguez, J., Su, H., Hoang, A. A., Lavian, M., Sun, X., O’Dowd, D. K. Cav2-type calcium channels encoded by cac regulate AP-independent neurotransmitter release at cholinergic synapses in adult Drosophila brain. J. Neurophysiol. 101, 42-53 (2009).
- Baines, R. A., Bate, M. Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo. J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).
- Lin, W. H., Wright, D. E., Muraro, N. I., Baines, R. A. Alternative splicing in the voltage-gated sodium channel DmNav regulates activation, inactivation, and persistent current. J. Neurophysiol. 102, 1994-2006 (2009).
- Worrell, J. W., Levine, R. B. Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ. J. Neurophysiol. 100, 868-878 (2008).
- Srinivasan, S., Lance, K., Levine, R. B. Segmental differences in firing properties and potassium currents in Drosophila larval motoneurons. J. Neurophysiol. , (2011).
- Choi, J. C., Park, D., Griffith, L. C. Electrophysiological and morphological characterization of identified motor neurons in the Drosophila third instar larva central nervous system. J. Neurophysiol. 91, 2353-2365 (2004).
- Pulver, S. R., Griffith, L. C. Spike integration and cellular memory in a rhythmic network from Na+/K+ pump current dynamics. Nat. Neurosci. 13, 53-59 (2010).
- Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila. PLoS Biol. 4, e63 (2006).
- Duch, C., Vonhoff, F., Ryglewski, S. Dendrite elongation and dendritic branching are affected separately by different forms of intrinsic motoneuron excitability. J. Neurophysiol. 100, 2525-2536 (2008).
- Ryglewski, S., Duch, C. Shaker and Shal mediate transient calcium-independent potassium current in a Drosophila flight motoneuron. J. Neurophysiol. 102, 3673-3688 (2009).
- Ryglewski, S., Lance, K., Levine, R. B., Duch, C. Cav2 Channels Mediate LVA and HVA Calcium Currents in Drosophila Motoneurons. J. Physiol. , (2011).
- Ikeda, K., Koenig, J. H. Morphological identification of the motor neurons innervating the dorsal longitudinal flight muscle of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 1273, 436-444 (1988).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection. J. Vis. Exp. (52), e3080 (2011).
