Engineering skeletmuskel Væv fra murine myoblast progenitorceller og anvendelse af elektrisk stimulering
Summary
Engineered muskelvæv har et stort potentiale i regenerativ medicin, som sygdommen model og også som en alternativ kilde til kød. Her beskriver vi konstruktionen af en muskel-konstruktion, i dette tilfælde fra muse myoblast progenitorceller, og en stimulering af elektriske impulser.
Abstract
Manipuleret muskelvæv kan anvendes til flere formål, der omfatter fremstilling af væv til anvendelse som en sygdomsmodel in vitro, fx til at studere tryksår, for regenerativ medicin og som kød alternativ 1. De første rapporterede 3D muskel konstruktioner er blevet gjort for mange år siden og pionerer på området er Vandenburgh og kolleger 2,3. Fremskridtene i muskelvæv engineering er ikke kun resultatet fra det store gevinst i viden om biokemiske faktorer, stamceller og stamceller, men er især baseret på indsigt opnået af forskere, at fysiske faktorer spiller afgørende roller i kontrollen af cellernes adfærd og vævsudvikling. State-of-the-art manipuleret muskel konstruktioner består i øjeblikket af celle-befolkede hydrogel konstruktioner. I vores laboratorium Disse består af murine myoblast progenitorceller, isoleret fra murine bagben muskler eller en murin myoblast cellelinje C2C12, miXED med en blanding af collagen / Matrigel og udpladet mellem to forankringspunkter, efterligne den muskel ledbånd. Andre celler kan betragtes som godt, f.eks alternative cellelinjer, såsom L6-myoblaster fra rotter 4, neonatal muskel progenitorceller 5, celler afledt fra voksne muskelvæv fra andre arter, såsom human 6 eller endda induceret pluripotente stamceller (iPS celler) 7 . Cellesammentrækningsevne bevirker tilpasning af cellerne langs den lange akse af konstruktionen 8,9 og differentiering af muskel progenitorceller efter cirka en uge i kultur. Endvidere kan anvendelsen af elektrisk stimulering forbedre processen til differentiering til en vis grad 8. På grund af sin begrænsede størrelse (8 x 2 x 0,5 mm) den komplette væv kan analyseres ved hjælp af konfokal mikroskopi til at overvåge fx levedygtighed, differentiering og cellejustering. Afhængigt af den specifikke anvendelse kravene til engineerøde muskelvæv vil variere, fx anvendelse til regenerativ medicin kræver opskalering af væv størrelse og vaskularisering, medens at tjene som en kød alternativ oversættelse til andre arter er nødvendig.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den teknik af muskelvæv har et stort potentiale for anvendelse som en sygdom model, til drug screening, regenerativ medicin og til kødproduktion. Men kravene til disse applikationer varierer. Vi valgte at arbejde med en blanding af kollagen og Matrigel, fordi collagen tillader cellejustering og fordi myoblast progenitorceller kræver tilstedeværelse af basalmembran afledte proteiner som bestemt i tidligere 2D studier 12. Desuden har fibringeler blevet testet i vores laboratorium og synes ikke at støtte de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Yabin Wu til dyrkning af væv præsenteret i figur 2, blev billedet taget af Bart van Overbeeke. Arbejdet blev støttet af SenterNovem, tilskud ISO 42.022.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Matrigel-growth factor reduced | Beckton and Dickinson | ||
| DMEM (high glucose)* | Gibco | 42430 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Horse serum | Gibco | 65050-122 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| 0.45 and 0.22 μm syringe filter* | Whatmann (Schleicher and Scheull) | 10462100 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipettes | |
| Chick embryo extract | United States Biological | C3999 | |
| Pasteur pipette* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 0,9 – 1,1 mm | |
| Pasteur pipette* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 1,4 – 1,6 mm | |
| Pasteur pipette | VWR | 612-1702 | |
| Collagenase type I* | Sigma | C0130-16 | |
| 40 μm cell strainer* | BD Falcon | 352340 | |
| 19G needle | |||
| Elastomer | Dow Corning corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Curing agent | Dow Corning corporation | Silastic MDX 4-4210# | |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Collagen type I, rat tail | BD Biosciences | 3544236 | |
| C-Pace EP Culture Pacer | Ionoptix | ||
| 6-well culture dishes for electrical stimulation | Beckton Dickinson-Falcon | BD Falcon #353846 | |
| C-Dish culture dish electrodes | Ionoptix | ||
| * Needed for the isolation of cells (point 1.1) # Together in one kit |
References
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Polak, R. B., et al. Meet the new meat: tissue engineered skeletal muscle. Trends Food Sci. Tech. 21 (2), 59-66 (2010).
- Shansky, J., Chromiak, J., Tatto, M., Vandenburgh, H. A simplified method for tissue engineering skeletal muscle organoids in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Animal. 33 (9), 659-661 (1997).
- Vandenburgh, H., Del Tatto, M., Shansky, J., et al. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum. Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61 (2), 477-483 (1968).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J. Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Koning, M., Werker, P. M. N., vander Schaft, D. W. J., Bank, R. A., Harmsen, M. C. MicroRNA-1 and MicroRNA-206 Improve Differentiation Potential of Human Satellite Cells: A Novel Approach for Tissue Engineering of Skeletal Muscle. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Darabi, R., Pan, W., Bosnakovski, D., et al. Functional myogenic engraftment from mouse iPS cells. Stem Cell Rev. 7 (4), 948-957 (2011).
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. J. Tissue Eng. Regen. Med. 5 (7), 529-539 (2011).
- van der Schaft, D., van Spreeuwel, A. C., van Assen, H. C., Baaijens, F. Mechanoregulation of vascularization in aligned tissue engineered muscle; a role for VEGF. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Shefer, G., Wleklinski-Lee, M., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway. J. Cell. Sci. 117 (Pt. 22), 5393-5404 (2004).
- Collins, C. A., Olsen, I., Zammit, P. S., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., Baaijens, F. P. T., van der Schaft, D. W. J., Post, M. J. Essential environmental cues from the satellite cell niche: optimizing proliferation and differentiation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296 (6), C1338-C1345 (2009).
- Li, Y., Pan, H., Huard, J. Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues. J. Vis. Exp. (41), e2011 (2010).
- Boonen, K. J. M., Langelaan, M. L. P., Polak, R. B., et al. Effects of a combined mechanical stimulation protocol: Value for skeletal muscle tissue engineering. J. Biomech. 43 (8), 1514-1521 (2010).
- Gawlitta, D., Boonen, K. J. M., Oomens, C. W. J., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. The influence of serum-free culture conditions on skeletal muscle differentiation in a tissue-engineered model. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 161-171 (2008).
- Koning, M., van Luijn, M., van der Schaft, D. W. J., et al. Human skeletal muscle formation and engraftment In vivo is independent of preconditioning In vitro with HUVEC. , (2013).
- Levenberg, S., Rouwkema, J., Macdonald, M., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat. Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).
- Koffler, J., Kaufman-Francis, K., Yulia, S., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (36), 14789-14794 (2011).
