Os tecidos músculo esquelético de engenharia a partir de células progenitoras mioblastos murinos e Aplicação da estimulação elétrica

Summary

Tecido muscular de engenharia tem um grande potencial na medicina regenerativa, como modelo de doença e também como uma fonte alternativa para a carne. Aqui descreve-se a engenharia de uma construção de músculo, neste caso, a partir de células progenitoras, mioblastos de rato e a estimulação por pulsos eléctricos.

Abstract

Tecidos musculares engenharia pode ser utilizado para diversos fins, que incluem a produção de tecidos para utilização como um modelo de doença in vitro, por exemplo, para estudar as úlceras de pressão, para a medicina regenerativa e como uma alternativa a carne ^1. As primeiras construções relatados musculares 3D foram feitos há muitos anos e pioneiros no campo são Vandenburgh e colegas ^2,3. Avanços na engenharia de tecidos músculo não são apenas o resultado do ganho enorme no conhecimento de fatores bioquímicos, células-tronco e células progenitoras, mas estão em base particular em conhecimentos obtidos por pesquisadores que os fatores físicos desempenham papéis essenciais no controle do comportamento de células e tecidos de desenvolvimento. Estado-da-arte da engenharia muscular constrói atualmente consistem de construções de células-povoadas de hidrogel. No nosso laboratório que geralmente são constituídos por células mioblastos de murino progenitoras isoladas, a partir de murinos músculos dos membros posteriores ou de uma linha celular C2C12 de mioblastos de murino, mixado com uma mistura de colagénio / Matrigel e semeadas entre dois pontos de ancoragem, que imita os ligamentos musculares. Outras células podem ser considerados, bem como, por exemplo, linhas celulares alternativos, tais como os mioblastos L6 de rato neonatal musculares ^4, células progenitoras, células derivadas ⁵ derivadas de tecidos musculares adultas a partir de outras espécies, tais como ⁶ humana ou células pluripotentes estaminais ainda induzidas (células iPS) ⁷ . Contractilidade celular faz com que o alinhamento das células ao longo do eixo longitudinal da construção de ^8,9 e diferenciação das células progenitoras musculares após cerca de uma semana de cultura. Além disso, a aplicação de estimulação eléctrica pode melhorar o processo de diferenciação, em certa medida ^8. Devido ao seu tamanho limitado (8 x 2 x 0,5 mm) do tecido completo pode ser analisada utilizando microscopia confocal para monitorar a viabilidade por exemplo, diferenciação de células e de alinhamento. Dependendo da aplicação específica, os requisitos para a engineetecido muscular vermelho pode variar; por exemplo, utilização em medicina regenerativa requer o escalonamento do tamanho dos tecidos e a vascularização, enquanto para servir como uma tradução alternativa a outras espécies de carne é necessário.

Protocol

1. Cultura de Células de mioblastos de murino progenitoras ou células C2C12 Isolar as células de acordo com o protocolo inicialmente publicado por Shefer e colegas 10 e posterior adaptada por Collins et al. 11 e Boonen et al. 12 e armazená-los em azoto líquido. Isto requer ratos, por exemplo, C57BL / 6. Os métodos alternativos são usadas em outros laboratórios, por exemplo, um método publicado em Journal of Experiments visualizadas …

Representative Results

O produto final será construções musculares, como indicado na Figura 3. O tamanho do tecido será de aproximadamente 8 mm de comprimento, 2 mm de largura e 0,5 mm de espessura. A estimulação eléctrica durante a diferenciação vai alterar a expressão das isoformas de cadeia pesada de miosina, mas não aumentar grandemente o processo de diferenciação, tal como induzida pelo meio de diferenciação 8, mas a estimulação eléctrica também pode ser aplicado no final do processo para verificar a f…

Discussion

A engenharia de tecidos musculares tem um grande potencial para a utilização como um modelo de doença, para a triagem de drogas, em medicina regenerativa e para a produção de carne. No entanto, os requisitos para estas aplicações variar. Optou-se por trabalhar com uma combinação de colagénio e de matrigel, porque permite o alinhamento de colagénio e células porque as células progenitoras mioblastos requerem a presença de proteínas de membrana basal derivadas, tal como determinado em estudos anteriores 2D …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Matrigel-growth factor reduced	Beckton and Dickinson
DMEM (high glucose)*	Gibco	42430
Advanced DMEM	Gibco	12491
Horse serum	Gibco	65050-122
Fetal bovine serum	Greiner	758075
0.45 and 0.22 μm syringe filter*	Whatmann (Schleicher and Scheull)	10462100
L-glutamine	Gibco	25030024
Penicillin/streptomycin	Gibco	10378016
Amphotericin	Gibco	15290-018
Culture plastic	Greiner		Includes culture flasks and pipettes
Chick embryo extract	United States Biological	C3999
Pasteur pipette*	Hilgenberg		Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 0,9 – 1,1 mm
Pasteur pipette*	Hilgenberg		Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 1,4 – 1,6 mm
Pasteur pipette	VWR	612-1702
Collagenase type I*	Sigma	C0130-16
40 μm cell strainer*	BD Falcon	352340
19G needle
Elastomer	Dow Corning corporation	3097358-1004	Silastic MDX 4-4210#
Curing agent	Dow Corning corporation		Silastic MDX 4-4210#
Velcro	Regular store		You can buy this at a regular store, only use the soft side
Collagen type I, rat tail	BD Biosciences	3544236
C-Pace EP Culture Pacer	Ionoptix
6-well culture dishes for electrical stimulation	Beckton Dickinson-Falcon	BD Falcon #353846
C-Dish culture dish electrodes	Ionoptix
			* Needed for the isolation of cells (point 1.1) # Together in one kit