Bacteriële Detection & Identification gebruiken elektrochemische sensoren

Summary

We beschrijven een elektrochemische sensor bepalingsmethode voor snelle bacteriële detectie en identificatie. De bepaling omvat een sensor-array gefunctionaliseerd met DNA oligonucleotide capture probes voor ribosomaal RNA (rRNA) species-specifieke sequenties. Sandwich hybridisatie van doelwit rRNA met de invangingsprobe en een mierikswortel peroxidase-linked DNA-oligonucleotide probe detector produceert een meetbare amperometrisch stroom.

Abstract

Elektrochemische sensoren worden veel gebruikt voor snelle en nauwkeurige meting van bloedglucose en kan worden aangepast voor de detectie van een groot aantal analyten. Elektrochemische sensoren werken door transducing een biologische gebeurtenis erkenning tot een bruikbaar elektrisch signaal. Signaaltransductie vindt plaats door het koppelen van de activiteit van een redox-enzym een ​​amperometrische elektrode. Sensor specificiteit ofwel inherent aan het enzym glucose oxidase in het geval van een glucose sensor, of een product van de koppeling tussen het enzym en een antilichaam of probe.

Hier beschrijven we een elektrochemische sensor testwerkwijze direct detecteren en identificeren van bacteriën. In alle gevallen, de hier beschreven probes DNA oligonucleotiden. Deze methode is gebaseerd op de sandwich hybridisatie van afvang en detector sondes met een doelgroep van ribosomaal RNA (rRNA). De capture probe is verankerd aan het sensoroppervlak, terwijl de detector probe is gekoppeld aan horseradish peroxidase (HRP). Wanneer een substraat zoals 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) werd toegevoegd aan een elektrode met capture-detector-target complexen gebonden aan het oppervlak, wordt het substraat geoxideerd door HRP en verminderd met de werkelektrode. Deze redox cyclus resulteert in shuttling van elektronen door het substraat van de elektrode naar HRP, produceren stroom door de elektrode.

Introduction

Gebruik rRNA als doelmolecuul voor bacteriële detectie en identificatie heeft een aantal voordelen. De overvloed van rRNA in bacteriële cellen voorziet in een gevoeligheidslimiet zo laag als 250 bacteriën per milliliter zonder dat doelamplificatie ^1. Bacteriële rRNA bevat unieke soort-specifieke sequenties die toegankelijk zijn voor hybridisatie met DNA probes. Bijgevolg kan een reeks van elektrochemische sensoren worden gebruikt om onbekende bacteriën, waarbij elke sensor is gefunctionaliseerd met een ander species-specifiek capture probe te identificeren. Positieve controle sensoren moeten worden opgenomen voor een synthetisch oligonucleotide doel dat "bruggen" het vangen en sondes detector een interne kalibratie-signaal te creëren.

Elektrochemische sensoren hebben een breed scala van fundamenteel en translationeel onderzoek toepassingen. Bijvoorbeeld, de assay beschreven is gebruikt om het effect van E. nauwkeurig te meten coli groeifase op RRNA en pre-rRNA aantallen kopieën, die van groot belang voor onderzoekers geïnteresseerd in bacteriële fysiologie ^2. De gevoeligheid van de elektrochemische sensor assay wordt bepaald door de signaal-ruisverhouding. Een verscheidenheid van signaalversterking en methoden ruisonderdrukking zijn onderzocht. We zien dat verbetering van de chemie van het sensoroppervlak is de sleutel tot het verminderen van niet-specifieke binding van detector probe en / of HRP enzym. Met name is een gemengde monolaag van alkanedithiols en mercaptohexanol gebleken achtergrond beperken door het elektrodeoppervlak geheel behoud toegankelijkheid van de capture probe voor hybridisatie doel ^3. Deze oppervlakte chemie behandelingen zijn bijzonder belangrijk voor testen met een complexe biologische monsters.

Protocol

1. Functionaliseringen van elektrochemische sensoren Bereid de gethioleerde capture probe in een concentratie van 0,05 uM in 300 uM 1,6-hexaandithiol (HDT), 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA en incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 10 min . Incubatie van de gethioleerde vangprobe met HDT zodat de thiolgroep op de vangprobe wordt verminderd, wat resulteert in meer consistente resultaten. Breng een stroom stikstof tot kale goud 16 sensor-array chip (en) voor 5 sec om vocht …

Representative Results

We beschrijven een elektrochemische test die gelijk is gestructureerd om een ​​sandwich ELISA. Zoals getoond in figuur 1, doel ribosomaal RNA (rRNA) hybridisatie met capture detector en probes wordt ontwikkeld door een redox reactie gekatalyseerd door HRP geconjugeerd aan anti-fluoresceïne antilichaam fragmenten die binden aan het 3'-fluoresceïne koppeling op de detector probe. Een belangrijk onderdeel van assaygevoeligheid is de oppervlaktechemie van de goudelektrode. Wij hebben gevonden dat …

Discussion

De elektrochemische sensor assay beschreven maakt een snelle detectie van nucleïnezuurdoelen. Sensitiviteit en specificiteit hangen gedeeltelijk van de vrije energie van target-probe hybridisatie, op zijn beurt afhankelijk van de lengte en het GC-gehalte van de opname en probes detector. We meestal uit te voeren de stappen hybridisatie bij kamertemperatuur (~ 20 ° C) ^{5, 6.} De stappen hybridisatie (3.2 en 3.3) kan worden bij hogere temperaturen in een hybridisatie oven uitgevoerd als de chip wordt geplaatst …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
6-mercapto-1-hexanol (MCH)	Sigma	451088	Store at room temperature
1,6-hexanedithiol (HDT)	Sigma	H-12005	Store at room temperature
Thiolated capture probes	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Fluorescein-modified detector probes	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Bridging Oligonucleotide	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments	Roche	11 426 346 910	Store at 4 °C
Helios Chip Reader	GeneFluidics	GFR-2009
Sensor Chip Mount	GeneFluidics	GFR-003
Film well sticker	GeneFluidics		Shipped with sensor chips
Bare gold 16-sensor array chips	GeneFluidics	SC1000-16X-B	Store in 100% N2 at room temperature
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906	Store at 4 °C
1M Phosphate Buffer, pH 7.2			0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2
Blocker Casein in PBS	Pierce	37528	Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C
			Table 1. Reagents and Equipment.